Хроническая тазовая боль (ХТБ) является общей потенциально подрывающей здоровье проблемой женщин как репродуктивного, так и перименопаузального возраста [2]. Неуклонное увеличение ее распространенности, а также низкая эффективность лечения привели к тому, что в последние годы научный интерес к ХТБ значительно возрос.
Считают, что ХТБ в 73,1% случаев — симптом гинекологических заболеваний, в 23,9% — экстрагенитальных, в 1,5% — психических нарушений и в 1,5% случаев имеет самостоятельное нозологическое значение. В последнее время, особенно во франко- и испаноязычных медицинских кругах, значительно изменился подход к патогенезу, диагностике и лечению заболеваний органов малого таза, сопровождающихся ХТБ [3]. Аденомиоз является одной из существенных, а по данным некоторых авторов, определяющей причиной развития ХТБ, равно как и дисменореи и гиперменореи [1, 4, 11].
В последние годы аденомиоз рассматривают как самостоятельную нозологическую единицу, отличающуюся автономным и инвазивным ростом, изменением молекулярно-биологических свойств клеток как эктопического, так и эутопического эндометрия [1]. В связи с этим перспективным направлением в изучении этиологии и патогенеза ХТБ при аденомиозе признано исследование молекулярно-биологических особенностей эутопического и эктопического эндометрия — экспрессии рецепторов эстрогенов (ER), маркеров пролиферации, апоптоза, адгезии, ангиогенеза, клеточной инвазии.
Равновесие в жизнедеятельности клеток связано с двумя динамическими разнонаправленными процессами: митотической активностью и гибелью клеточных популяций. Нарушение нормального контроля гибели клеток вызывает изменение гомеостаза и приводит к различным заболеваниям. Апоптоз (запрограммированная гибель клеток) запускается внутренними и внешними сигналами и требует затраты энергии, транскрипции генов и синтеза белка de novo. Апоптоз играет одну из главных ролей в патофизиологии аденомиоза. В то же время уровень клеточной пролиферации отражает тканевую активность. Пролиферирующие клетки могут быть идентифицированы путем изучения ядерной экспрессии Ki-67 — протеина, который вырабатывается в течение всех фаз менструального цикла. Во многих исследованиях установлена корреляция между экспрессией Ki-67 и количеством митотических клеток [7]. Снижение восприимчивости эндометриальных эпителиальных и стромальных клеток к апоптозу ассоциируется с ХТБ при эндометриозе [11].
Несмотря на большое количество теорий, посвященных причинам развития аденомиоза, механизмы его патогенеза до настоящего времени до конца не изучены. Настоящее исследование выполнено для расширения представлений о роли пролиферации и апоптоза эктопического и эутопического эндометрия при аденомиозе, сопровождающемся синдромом ХТБ.
Цель работы: оценить состояние механизмов пролиферации и апоптоза в экто- и эутопическом эндометрии в теле матки при аденомиозе, сопровождающемся ХТБ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Морфологические и иммуногистохимические исследования выполняли в отделе патоморфологии ЦНИЛ Донецкого национального медицинского университета имени М. Горького и в патолого-анатомическом отделении НИИ урологии Минздрава России (заведующий отделением — к. м. н. Г. Д. Ефремов). Процедуру подсчета выполняли дважды два независимых эксперта (двойное слепое исследование), не осведомленные о диагнозе и клинических характеристиках пациенток. Уровень конкордантности морфометрических результатов, полученных от независимых экспертов, составлял более 95%.
Для морфологического исследования использовали фрагменты макропрепаратов стенок 60 маток, полученных при гистерэктомии у пациенток с диффузным аденомиозом II–III степени, сопровождавшимся выраженным болевым синдромом длительностью более 6 месяцев. Женщины были прооперированы в пролиферативную фазу цикла.
После гистерэктомии участки стенки матки, включавшие эндометрий и миометрий, фиксировали в нейтральном забуференном 10%-м формалине (pН = 7,4) в течение 24 часов. После дегидратации материал заливали в высокоочищенный парафин с полимерными добавками (Richard-Allan Scientific, США) при температуре не выше 60 °С. Срезы толщиной 1–5 мкм получали на ротационном микротоме Microm HM325 с системой переноса срезов STS (Carl Zeiss, Германия). По два среза с каждого блока помещали на адгезивное предметное стекло SuperFrost Plus (Menzel, Германия). Общую морфологическую оценку срезов проводили при окраске гематоксилином и эозином. При этом оценивали наличие, количество и глубину расположения маточных желез (эктопического эндометрия) в миометрии. Для оценки характера межклеточных коопераций иммуногистохимически визуализировали различные линии клеток.
Для изучения кинетики клеток оценивали их пролиферацию и апоптоз с помощью моноклональных антител (МАТ) к Ki-67 (клон DO-7) и р53 (клон MM1; DAKО, Дания) соответственно. Чувствительность к эстрогенам определяли с использованием МАТ к ЕR. Для «демаскировки» антигенов регидратированные срезы подвергали термической обработке в растворе Target Retrieval Solution (DAKO) с использованием бытовой микроволновой печи Samsung CE118KFR при 450 Вт 3 раза по 3,5 минуты. После блокирования эндогенной пероксидазной активности пероксидазным блоком (DAKO) и неспецифического связывания белков протеиновым блоком (DAKO) наносили первичные антитела. Визуализацию первичных антител проводили с помощью полимерной системы детекции DAKO EnVision+. В качестве субстрата для пероксидазы хрена использовали DAB+ (DAKO). Препараты докрашивали гематоксилином Майера. Далее окрашенные срезы заключали в полусинтетическую среду Permanent Mounting Medium (DAKO).
С целью объективизации морфологического исследования использовали комплексный морфометрический анализ, который производили с помощью специального программного обеспечения ImageTool (version 3.0) и графического редактора Adobe Photoshop CS4 Extended (version 11.0.1). Снимки выполнены на микроскопе Olympus BX51 с цифровой камерой DP70 (Olympus, Япония).
В исследованиях с использованием МАТ к Ki-67, p53 оценивали удельную плотность иммунопозитивных клеток (количество окрашенных в коричневый цвет клеток на сотню клеток в поле зрения). Оценку количества клеток проводили в 10 разных полях зрения каждого препарата при 200-кратном увеличении (окуляр 10, объектив 40), соответствовавшем 0,785 мм2/поле зрения, с участием двух независимых специалистов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка эутопического эндометрия у пациенток с аденомиозом продемонстрировала соответствие структуры фазе пролиферации менструального цикла. Покровный эпителий характеризовался присутствием большого количества пролиферирующих клеток (12,8 ± 2,7%; 95%-й ДИ: 6,5–20,7%) и признаками незрелости, к числу которых относились высокое ядерно-цитоплазматическое отношение и отсутствие развитого апикального полюса. Железы составляли 28,4 ± 3,2% (95%-й ДИ: 23,4–33,2%) объема эндометрия, имели местами извитой ход с формированием локальных расширений, преимущественно в глубине эндометрия.
В структуре маточных желез максимальное количество митозов отмечали в областях шейки и дна, где Ki-67-иммунопозитивных клеток было соответственно 17,3 ± 2,8% и 23,5 ± 3,6%. В области тела маточных желез доля пролиферирующих клеток не превышала 6%. При этом высокая скорость пролиферации эпителия эндометрия вела к формированию картины псевдомногорядности (за счет тесного расположения ядер при отсутствии четко выраженного апикального полюса клеток маточных желез).
Характерно, что в строме эутопического эндометрия также наблюдали пролиферацию клеток, однако численность пролиферирующих клеток была ниже, чем в эпителиальных структурах эндометрия, — она составляла 8,8 ± 4,2% (95%-й ДИ: 5,3–11,8%), — хотя строма характеризовалась высокой плотностью расположения клеток. Последнее было связано с наличием лимфоцитарной инфильтрации. При этом количество клеток, экспрессирующих маркер апоптоза р53, было крайне низким и не превышало 2% у всех пациенток с аденомиозом.
Важно также отметить, что формирующийся функциональный слой эндометрия был богат кровеносными сосудами, часть которых была дилатирована и заполнена эритроцитами. Полученные нами данные в целом согласуются с результатами исследований, выявлявших различное по степени повышение пролиферативной активности и снижение интенсивности процессов апоптоза в клетках эутопического эндометрия при разных формах эндометриоза [5, 6, 8, 9].
В некоторых участках стенки матки отмечали инвазию маточных желез вглубь эндометрия. Форма и размер желез при этом варьировали. В отдельных случаях наблюдали инвазию единичных трубчатых неразветвленных желез в миометрий. Однако чаще всего имело место гроздевидное врастание маточных желез вглубь миометрия. Последнее ассоциировалось с нарушением морфогенеза желез и усилением их ветвлений.
Такая картина, по сути, отражает нарушение эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, лежащих в основе не только эмбрионального роста, но и физиологического и патологического ремоделирования тканей и органов. С нарушением межтканевых отношений при эндометриозе связывают также развитие эпителиально-мезенхимальной трансформации, сопровождающейся изменением локального микроокружения и концентрации факторов роста [10]. Неудивительно, что гроздевидные очаги эктопических маточных желез, в отличие от очагов единичной инвазии, были окружены большим объемом стромы.
Интересно, что количество делящихся клеток в кистозно расширенных участках было меньше, чем в железах, сохранявших трубчатую структуру. Даже на участках десквамации клеток в просвет расширенных желез определялись Ki-67-позитивные клетки. Кроме того, обращала на себя внимание относительно низкая экспрессия Ki-67 в миометрии, несмотря на наличие признаков гиперплазии, предопределяющих увеличение размеров матки. Данный маркер визуализировали лишь в незначительном (до 1%) количестве гладких миоцитов при диффузном распределении иммунопозитивных клеток в миометрии. Несмотря на высокую скорость пролиферации эпителиальных клеток эндометрия, в них оказалась чрезвычайно низкой экспрессия р53, что отражает снижение интенсивности апоптоза.
Данный феномен может быть обусловлен высокой экспрессией ER и действием эстрогенов, для которых характерен выраженный антиапоптогенный эффект. Иммуногистохимическое исследование продемонстрировало максимальную экспрессию ER в эпителиальных клетках как эутопического, так и эктопического эндометрия, которая охватывала 99–100% клеток, что вполне закономерно в фазу пролиферации менструального цикла и согласуется с данными литературы о выраженной зависимости интенсивности тазовой боли вследствие эндометриоза от уровня эстрогенов [12].
Высокой оказалась и чувствительность стромальных клеток эндометрия к эстрогенам. Интересно, что при этом интенсивность и пространственные характеристики экспрессии ER в строме эндометрия не были связаны с пролиферативными процессами. Кроме того, данный вид рецепторов визуализировался как в ядрах фибробластоподобных клеток эндометрия, так и в мигрирующем пуле, за исключением незначительного количества лимфоцитов.
Характерно, что в миометрии выраженность экспрессии ER оказалась существенно ниже по сравнению с эндометрием. Более того, некоторые гладкие миоциты оказались иммунонегативными: до 20% клеток миометрия не экспрессировали ER, что отражает мозаичное выпадение экспрессии рецепторов к половым стероидам в миометрии. При этом многочисленные тонкие пучки гладких миоцитов были дезорганизованы (разнонаправлены) и разделены прослойками стромы с многочисленными кровеносными сосудами во всех слоях эндометрия. Интересно, что в строме между пучками гладких миоцитов была выявлена низкая экспрессия ER, что, вероятно, связано с инфильтрацией стромы лимфоцитами.
Однако отдельные наши предположения не нашли подтверждения, в частности гипотеза о пролиферативной активности индукторов и ингибиторов апоптоза, уровнях экспрессии ER [12]. В определенной мере это, по-видимому, связано с тем, что изучению и сравнению были подвергнуты образцы с различными изменениями эутопического эндометрия, включая гиперпластические и воспалительные, взятые в разные фазы менструального цикла и в постменопаузе у женщин с разными формами и стадиями развития внутреннего и наружного генитального эндометриоза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При хронической тазовой боли, обусловленной аденомиозом, регистрируется нарушение эпителиально-мезенхимальных отношений, отражающее дефектный морфогенез маточных желез. Это сопровождается усилением пролиферации эпителиальных клеток на фоне высокой чувствительности эпителиальных и стромальных клеток к эстрогенам.
