Научно-практический медицинский рецензируемый журналISSN 1727-2378
Ru
En

Особенности изменений матриксных металлопротеиназ при заболеваниях поджелудочной железы

Библиографическая ссылка: Винокурова Л. В., Варванина Г. Г., Смирнова А. В., Гуляев А. С. и др. Особенности изменений матриксных металлопротеиназ при заболеваниях поджелудочной железы // Доктор.Ру. 2017. № 2 (131). С. 33-37.
Особенности изменений матриксных металлопротеиназ при заболеваниях поджелудочной железы
29 Марта 11:57
Д.С. Бордин, Л.В. Винокурова, Г.Г. Варванина, А.В. Смирнова, А.С. Гуляев, , Е.А. Дубцова

Цель исследования: анализ изменения содержания матриксных металлопротеиназ 2-го и 9-го типов (MMP-2 и MMP-9) и тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ 2-го типа (TIMP-2) в сыворотке крови больных хроническим панкреатитом (ХП) и раком поджелудочной железы (ПЖ); оценка их возможного значения для диагностики данных заболеваний.

Дизайн: проспективное сравнительное исследование.

Материалы и методы. Обследованы пациенты с раком головки ПЖ (n = 15), больные ХП с постнекротическими кистами ПЖ (ПНКПЖ, n = 23) и ХП без кистозных образований (n = 37), а также 13 человек без заболеваний органов пищеварения (контрольная группа). В крови, взятой натощак, иммуноферментным методом определяли концентрации ММР-2, ММР-9 и TIMP-2.

Результаты. Выявлено статистически значимое повышение количества ММР-9 в сыворотке крови пациентов с раком ПЖ и больных ХП без кистозных образований с длительностью ХП от 6 до 15 лет по сравнению с контролем. Статистически значимых различий между группами по концентрации ММР-2 найдено не было. У пациентов с ХП и ПНКПЖ обнаружено достоверное уменьшение концентрации TIMP-2 по сравнению с больными ХП без кистозных образований.

Заключение. При длительном течении ХП повышен риск развития рака ПЖ. Уровень ММР-9 может быть дополнительным критерием при определении индивидуального прогноза у больных ХП. Изменения данного показателя максимальны у больных раком головки ПЖ. Изучение показателей системы MMP и их ингибиторов является актуальной и клинически значимой задачей в связи с возможностью их использования с диагностической и прогностической целью при раке и воспалительных заболеваниях ПЖ.

Ключевые слова: хронический панкреатит, поджелудочная железа, матриксные металлопротеиназы.

Бордин Дмитрий Станиславович — д. м. н., заведующий отделом патологии поджелудочной железы, желчных путей и верхних отделов пищеварительного тракта ГБУЗ МКНЦ ДЗМ; профессор кафедры общей врачебной практики (семейной медицины) факультета дополнительного профессионального образования, интернатуры и ординатуры ФГБОУ ВО «Тверской ГМУ» Минздрава России; ученый секретарь Российского панкреатологического клуба. 111123, г. Москва, ш. Энтузиастов, д. 86. E-mail: d.bordin@mknc.ru

Варванина Галина Григорьевна — д. м. н., старший научный сотрудник лаборатории научно-диагностических исследований ГБУЗ МКНЦ ДЗМ. 111123, г. Москва, ш. Энтузиастов, д. 86. E-mail: varvaninag@mail.ru

Винокурова Людмила Васильевна — д. м. н., ведущий научный сотрудник отделения патологии поджелудочной железы и желчевыводящих путей ГБУЗ МКНЦ ДЗМ. 111123, г. Москва, ш. Энтузиастов, д. 86. E-mail: vinokurova1952@mail.ru

Гуляев Андрей Сергеевич — научный сотрудник лаборатории организации генома ФГБУН ИБГ РАН; заведующий экспериментальной клиникой лаборатории доклинических исследований ГБУЗ МКНЦ ДЗМ. 111123, г. Москва, ш. Энтузиастов, д. 86. E-mail: guliaev@genebiology.ru

Дубцова Елена Анатольевна — д. м. н., заведующая отделением патологии поджелудочной железы и желчевыводящих путей ГБУЗ МКНЦ ДЗМ. 111123, г. Москва, ш. Энтузиастов, д. 86. E-mail: e.dubtsova@mknc.ru

Смирнова Анна Вячеславна — научный сотрудник лаборатории доклинических исследований ГБУЗ МКНЦ ДЗМ; научный сотрудник лаборатории лучевых и радионуклидных технологий в экспериментальной онкологии НИИ клинической и экспериментальной радиологии ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина Минздрава России. 111123, г. Москва, ш. Энтузиастов, д. 86. E-mail: smirn-ova@mail.ru

В экономически развитых странах хронический панкреатит (ХП) является актуальной медико-социальной проблемой ввиду распространенности алкогольной зависимости и табакокурения [1, 2, 7].

Установлено, что при наличии в анамнезе ХП риск развития рака поджелудочной железы (ПЖ) в течение 20 лет повышается в 5 раз. Анализ статистических данных, проведенный в США, выявил, что параллельно с ростом заболеваемости ХП имеет место троекратное увеличение смертности от рака ПЖ [8, 23]. При опухолях ПЖ выживаемость больных в экономически развитых и развивающихся странах различается незначительно [6].

Воспаление как защитно-приспособительный биологический механизм имеет значение для поддержания структурно-морфологического гомеостаза ткани ПЖ. Развитие воспалительной реакции — сложный комплексный процесс с участием продуктов активации ферментных систем, острофазных белков, молекул адгезии, медиаторов, вазоактивных аминов, эйкозаноидов, хемокинов, кининов, комплемента, системы свертывания крови и др. [5].

В норме гиперпролиферация направлена на восполнение полноценного и функционально зрелого участка пораженной ткани ПЖ. В условиях гипоксии и воспаления клетки изменяют свои физиологические параметры и со временем приобретают злокачественный потенциал. В дальнейшем возникает феномен субклонирования трансформированных клонов — формируются условия для иммунологической резистентности к опухолевым клеткам в зоне воспаления. Это приводит к росту опухолевого очага [12].

Взаимосвязь клеток друг с другом обеспечивается белками адгезии и целой системой матриксных металлопротеиназ (MMP). Регуляторами этой системы в норме являются тканеспецифические ингибиторы (тканевые ингибиторы металлопротеиназ — англ. tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs). Процессы альтерации истощают клетки ПЖ и приводят к их дистрофии. Межклеточные контакты в зоне первично трансформированных клеток являются наиболее уязвимым компонентом при росте и развитии гиперпластического участка, и клетки легко теряют полноценную сцепленность друг с другом.

ММР — это 20 представителей семейства внеклеточных цинкзависимых эндопептидаз, способных разрушать все типы белков внеклеточного матрикса. Они необходимы для ремоделирования тканей, в процессе ангиогенеза, для поддержания нормальной интенсивности пролиферации, миграции и дифференциации клеток. ММР участвуют в ингибировании и активации апоптоза, сдерживая рост измененных клеток, задействованы в расщеплении мембранных рецепторов, выбросе апоптозных лигандов (таких как FasL), а также в активации и деактивации хемокинов и цитокинов [9, 15, 16].

Таким образом, получение более полной информации о роли MMP и их игибиторов при воспалительных и связанных с воспалением опухолевых процессах является актуальным направлением медико-биологических исследований.

Целью нашей работы являлись анализ изменения содержания ММР-2, ММР-9 и TIMP-2 в сыворотке крови больных ХП и раком ПЖ, а также оценка их возможного значения для диагностики данных заболеваний.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование количественного изменения ММР-2, ММР-9 и TIMP-2 было проведено на базе Московского клинического научно-практического центра Департамента здравоохранения г. Москвы сотрудниками отделения патологии поджелудочной железы и желчевыводящих путей, лабораторий научно-диагностических и доклинических исследований в период 2014-2016 гг.

Обследованы 75 больных ХП и раком головки ПЖ. Пациенты с раком головки ПЖ вошли в первую группу (n = 15). Больные ХП с постнекротическими кистами ПЖ (ПНКПЖ) были выделены во вторую группу (n = 23). Третья группа обследованных включала в себя 37 больных ХП и состояла из пациентов с хроническим кальцифицирующим панкреатитом (n = 16), хроническим билиарным панкреатитом с холицистэктомией в анамнезе (n = 11), хроническим идиопатическим панкреатитом (n = 10). Группу контроля, или четвертую группу, составили 13 человек без заболеваний органов пищеварения. Характеристика выделенных групп представлена в таблице 1.

Таблица 1
Характеристика обследованных групп
6_1.jpg 
Примечание. В таблицах 1, 2, 4: КО — кистозные образования; ПНКПЖ — постнекротические кисты поджелудочной железы; РГПЖ — рак головки поджелудочной железы; ХП — хронический панкреатит.

Диагноз ХП и рака головки ПЖ был верифицирован на основании клинических, инструментальных и лабораторных данных. Рак головки ПЖ имел гистологическое подтверждение. Длительность ХП у больных с ПНКПЖ составляла от 2 до 5 лет, без кистозных образований — от 6 до 15 лет.
В крови, взятой натощак, определяли концентрации ММР-2, ММР-9 и TIMP-2 иммуноферментным методом с применением коммерческих наборов реактивов производства R&D Systems (США).

Статистический анализ различий медианных значений концентраций MMP-2, MMP-9 и TIMP-2 при различных заболеваниях и в контроле проводили с помощью теста Краскела — Уоллиса, для множественных попарных сравнений использовали post-hoc-тест Данна с поправкой Холма. Все расчеты и визуализацию результатов выполняли в компьютерной среде для статистических расчетов R (пакеты stats, PMCMR, ggplot2). Различия между группами считали статистически значимыми при значениях р ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ
В ходе исследования была сформулирована гипотеза о том, что развитие ХП, формирование кисты и/или опухоли головки ПЖ являются динамическим процессом, связанным с воспалительной реактивностью ПЖ. Для уточнения правомочности данной гипотезы были отобраны наиболее значимые показатели перестройки межклеточного матрикса в области воспаления: ММР-2, ММР-9 и ингибитор (TIMP-2).
Полученные данные представлены в таблице 2 в виде медианы (Me) и 25-75%-го интервала.

Таблица 2
Уровни матриксных металлопротеиназ и ингибитора в сыворотке крови больных хроническим панкреатитом и раком поджелудочной железы, нг/мл
6_2.jpg 

Учитывая данные литературы о возможности использования показателя ММР-9 в сыворотке крови в качестве маркера опухолевого роста в ПЖ [19], мы проанализировали пациентов с раком головки ПЖ (первая группа), больных ХП с ПНКПЖ и без кистозных образований (вторая и третья группы соответственно) и участников группы контроля. Как показало сравнение, изменения количества ММР-9 в сыворотке крови больных первой и третьей групп достоверно отличались от данных, полученных в группе контроля (р = 0,008 и р = 0,044 соответственно) (табл. 3, 4).

Таблица 3
Результаты теста Краскела — Уоллиса у больных групп исследования в сравнении с группой контроля
6_3.jpg 

Таблица 4
Результаты post-hoc-теста Данна (Dunn's test) для попарного сравнения концентраций MMP-9 и TIMP-2 в группах больных хроническим панкреатитом и раком поджелудочной железы
6_4.jpg 
Примечание. Для коррекции p-величины использован метод Холма.

Статистически значимых различий между концентрациями ММР-2 при сравнении представленных групп найдено не было, однако изучение данного вопроса требует продолжения, так как в настоящее время серьезно обсуждается смена парадигмы разработки диагностических критериев при подозрении на рак ПЖ [24, 25]. В частности, рекомендуется проведение анализа цитологического и гистологического материалов, которые получают во время операции и/или эндоскопического обследования.

Наименьшая средняя концентрация TIMP-2 была выявлена в группе ХП и ПНКПЖ, затем в группе больных, страдающих раком головки ПЖ, а максимальная — в группе ХП без кистозных образований (см. табл. 2). При сравнении групп ХП с наличием постнекротических кист и без кист обнаружено статистически значимое уменьшение концентрации TIMP-2 у пациентов с ПНКПЖ (р = 0,024) (см. табл. 4). Сравнение остальных групп статистически значимых изменений концентрации не выявило.

ОБСУЖДЕНИЕ
Наши данные показывают закономерные изменения способности системы матриксных металлопротеиназ (ММР-2 и ММР-9) и их ингибирующих белков (TIMP-2) реагировать на процесс воспаления и опухолевого роста. С учетом результатов представленного исследования встает ряд вопросов общебиологического и медицинского значения:

1) что является первым этапом в процессе опухолевой трансформации клеток ПЖ: фактор воспаления (и связанная с ним первичная трансформация клеток) или опосредованный воспалением и связанный с ним иммунный ответ, развивающийся в самой ткани, обеспечивающий выживаемость первично трансформированных клеток и их защиту по типу «опухолевого ускользания»?

2) как происходит ремоделирование межклеточных контактов в ответ на стимулы со стороны иммунной и эндокринной систем, что обеспечивает опухолевым клеткам способность к инвазии и последующему движению?

3) каким образом изменяется активность системы тканеспецифических ингибиторов при различных типах повреждения паренхимы ПЖ и опухолевом росте в этом органе, существуют ли принципиальные различия в системе сигнальных путей этих белков при воспалении, опухолевой трансформации и на более позднем этапе развития опухоли?

Все эти вопросы носят фундаментальный характер, но их решение позволит создать стратегии ранней диагностики рака ПЖ для групп риска: лиц, страдающих ХП более 6 лет и имеющих тяжелые нарушения структуры органа.
MMP выполняют важную местную регуляторную функцию: они проводят гидролиз основных белков межклеточного матрикса. MMP-9 (76,2 kDa) способствует миграции лейкоцитов. А так как она является ключевым звеном в организации стромы опухоли, ее биологические характеристики обусловливают интерес исследователей к ней как к маркеру злокачественного фенотипа опухолей [9, 10, 21]. Учитывая, что синтез ММР-9 является индуцибельным и связан с системой белков — медиаторов острой фазы воспаления, в том числе IL-1β, IL-4, IL-10, и активаторами NKT-клеток через систему рецепторов к липополисахаридам [24], важно установить ее место в процессе опухолевого роста.

В нашем исследовании для ММР-9 статистически значимые различия были выявлены между группами контроля и рака головки ПЖ (первая группа), а также между группами контроля и ХП без кистозных образований длительностью от 6 до 15 лет (третья группа). Статистически значимых различий по этому показателю между первой и третьей группами найдено не было, что указывает на выраженные изменения межклеточного матрикса, связанные прежде всего с продолжительным хроническим воспалением. Данные о необходимости более детального изучения системы металлопротеиназ согласуются с опубликованными результатами исследований [11, 14, 17, 18], в которых указывается на диагностическую ценность и физиологическую значимость данной системы для прогнозирования исхода и течения заболеваний ПЖ.

ММР-2 (72 kDa) — представитель семейства желатиназ, отвечающий за поддержание клеточного гомеостаза в зоне хронического воспаления [13]. Благодаря этому белку формируется зона первичного роста соединительной ткани в ответ на альтерацию и хемокиновый сигнал стромальным компонентам матрикса. Динамику изменения концентрации MMP-2 рассматривают как возможный маркер рака предстательной железы [20]. Однако при работе с гистологическим материалом, полученным от больных раком желудка, была показана диагностическая ценность иммуногистохимического исследования образцов [3]. Таким образом, изучение ММР-2 как фактора межклеточного взаимодействия в большей степени информативно для иммуногистохимического исследования, что существенно осложнено при работе с ПЖ.

Учитывая наличие ELISA-технологии, существует возможность определять динамику изменения этого маркера межклеточного ремоделирования в сыворотке крови, что является предпочтительной лабораторной методикой. В нашей работе был использовании метод количественного определения ММР-2 у обследованных пациентов. Однако статистически значимых изменений выявлено не было.

Воспалительная реакция всегда связана с изменением синтеза интегринов [22]. Между интегринами, MMP-2 и MMP-9 существует тесная взаимосвязь через систему белков FAK/ILK/ERK/PI3K/NF-κB. В норме это защитный механизм, обеспечивающий постоянство клеточного состава в ткани. При воспалении происходит активация интегриновых рецепторов, что изменяет интенсивность синтеза клеткой молекул ММР-2 и ММР-9. В дальнейшем это приводит к росту новых клеточных элементов в очаге повреждения целостности ткани. При опухолевом процессе активация той же системы обусловливает биодеградацию нормальных защитных барьеров в зоне первичного опухолевого роста и способствует активной инвазии клеток. Таким образом, ММР-2 и ММР-9 являются маркерами, косвенно указывающими на степень активации системы белков FAK/ILK/ERK/PI3K/NF-κB, что позволяет оценить глубину изменения в очаге воспаления и степень трансформации клеток, в нем находящихся. Учитывая наши данные, требуется уточнить, что ХП всегда сопровождается динамическими изменениями как со стороны паренхимы, так и со стороны соединительной ткани, которая постепенно замещает паренхиматозную. Это явление формирует предпосылки к грубому изменению и самих клеток, и их микроокружения.

TIMP-2 является ингибитором ММР-2, он также связан с перестройками межклеточных контактов в процессе приспособления органа к условиям ненормального биохимического регулирования клеточного гомеостаза [4, 13]. Изменение содержания TIMP-2 в тканях определяют несколькими методами, из которых наиболее чувствителен белковый гельэлектрофорез материала, полученного из образца ткани. Логично предположить, что его количество напрямую зависит от активности воспаления и деструкции тканей ПЖ, степени фиброгенеза и организации участков трансформации, что показало выявленное в нашем исследовании различие между группами ХП с длительностью заболевания от 2 до 5 лет и от 6 до 15 лет.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
У больных с длительно текущим хроническим панкреатитом (ХП) повышается риск развития рака поджелудочной железы (ПЖ). Уровень матриксной металлопротеиназы 9-го типа можно использовать в качестве дополнительного критерия при определении индивидуального прогноза у больных ХП. Изменения данного показателя максимальны у пациентов с раком головки ПЖ.

Оценивая результаты проведенного исследования, можно заключить, что изучение таких показателей, как система матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов, является актуальной и клинически значимой задачей в связи с возможностью их использования с диагностической и прогностической целью при раке и воспалительных заболеваниях ПЖ.

Особенности изменений матриксных металлопротеиназ при заболеваниях поджелудочной железы
29 Марта 11:57
ЛИТЕРАТУРА
  1. Андросова М. И., Варламова А. В. Подростковый алкоголизм как социальная проблема // Сб. статей: Исследование различных направлений развития психологии и педагогики / Отв. ред. А. А. Сукиасян. Уфа: Аэтерна, 2015. С. 6-8.
  2. Винокурова Л. В., Дубцова Е. А., Варванина Г. Г., Агафонов М. А. Функциональная недостаточность поджелудочной железы при хроническом панкреатите различной этиологии // Эффектив. фармакотерапия. Гастроэнтерология. 2012. № 2. С. 44-48.
  3. Гаганов Л. Е., Гуревич Л. Е., Устинова Е. И., Казанцева И. А. Экспрессия металлопротеиназ -2 и -3 в карциномах желудка при различных иммунофенотипических вариантах // Молекуляр. медицина. 2013. № 1. С. 34-37.
  4. Герштейн Е. С., Короткова Е. А., Пророков В. В., Кушлинский Е. Н. Клиническое значение исследования ассоциированных с опухолью протеаз в опухолях и плазме крови больных колоректальным раком // Молекуляр. медицина. 2013. № 1. С. 49-55.
  5. Недоспасов С. А. Врожденный иммунитет и его значение для биологии и медицины // Вестн. РАН. 2013. № 839 (9). С. 771-783.
  6. Одинцова И. Н., Писарева Л. Ф., Хряпенков А. В. Эпидемиология злокачественных новообразований в мире // Сиб. онкол. журн. 2015. № 5. С. 95-101.
  7. Паклина О. В. Морфогенез хронического панкреатита и протоковой аденокарциномы поджелудочной железы: Автореф. дис. … докт. мед. наук. Москва, 2009. 46 с.
  8. Степанов Ю. М., Гравировская Н. Г., Скирда И. Ю., Петишко О. П. Болезни поджелудочной железы как одна из ведущих проблем гастроэнтерологии и абдоминальной хирургии (современная эпидемиология) // Гастроентерологія. 2014. № 3. С. 7-14.
  9. Ellenrieder V., Alber B., Lacher U., Hendler S. F. et al. Role of MT-MMPs and MMP-2 in pancreatic cancer progression // Int. J. Cancer. 2000. Vol. 85. N 1. P. 14-20.
  10. Erkan M., Hausmann S., Michalski C. W., Fingerle A. A. et al. The role of stroma in pancreatic cancer: diagnostic and therapeutic implications // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2012. Vol. 9. N 8. P. 454-467.
  11. Ghaneh P., Kawesha A., Evans J. D., Neoptolemos J. P. Molecular prognostic markers in pancreatic cancer // J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 2002. Vol. 9. N 1. P. 1-11.
  12. Grivennikov S. I., Greten F. R., Karin M. Immunity, inflammation, and cancer // Cell. 2010. Vol. 140. N 6. P. 883-899.
  13. Kurzepa J., Mądro A., Czechowska G., Kurzepa J. et al. Role of MMP-2 and MMP-9 and their natural inhibitors in liver fibrosis, chronic pancreatitis and non-specific inflammatory bowel diseases // Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 2014. Vol. 13. N 6. P. 570-579.
  14. Määttä M., Soini Y., Liakka A., Autio-Harmainen H. Differential expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9, and membrane type 1-MMP in hepatocellular and pancreatic adenocarcinoma: implications for tumor progression and clinical prognosis // Clin. Cancer Res. 2000. Vol. 6. N 7. P. 2726-2734.
  15. Malemud C. J. Matrix metalloproteinases (MMPs) in health and disease: an overview // Front. Biosci. 2006. Vol. 11. P. 1696-1701.
  16. Medzhitov R. Inflammation 2010: new adventures of an old flame // Cell. 2010. Vol. 140. N 6. P. 771-776.
  17. Moz S., Basso D., Padoan A., Bozzato D. et al. Blood expression of matrix metalloproteinases 8 and 9 and of their inducers S100A8 and S100A9 supports diagnosis and prognosis of PDAC-associated diabetes mellitus // Clin. Chim. Acta. 2016. Vol. 456. P. 24-30.
  18. Mroczko B., Lukaszewicz-Zajac M., Wereszczynska-Siemiatkowska U., Groblewska M. et al. Clinical significance of the measurements of serum matrix metalloproteinase-9 and its inhibitor (tissue inhibitor of metalloproteinase-1) in patients with pancreatic cancer: metalloproteinase-9 as an independent prognostic factor // Pancreas. 2009. Vol. 38. N 6. P. 613-618.
  19. Ohuchida K., Ohtsuka T., Mizumoto K., Hashizume M. et al. Рак поджелудочной железы: клиническая значимость биомаркеров // Вестн. клуба панкреатологов. 2014. № 2. С. 27-30.
  20. Roy R., Zurakowski D., Wischhusen J., Frauenhoffer C. et al. Urinary TIMP-1 and MMP-2 levels detect the presence of pancreatic malignancies // Br. J. Cancer. 2014. Vol. 111. N 9. P. 1772-1779.
  21. Shi C., Washington M. K., Chaturvedi R., Drosos Y. et al. Fibrogenesis in pancreatic cancer is a dynamic process regulated by macrophage-stellate cell interaction // Lab. Invest. 2014. Vol. 94. N 4. P. 409-421.
  22. Stivarou T., Patsavoudi E. Extracellular molecules involved in cancer cell invasion // Cancers (Basel). 2015. Vol. 7. N 1. P. 238-265.
  23. Taylor B. Carcinoma of the head of the pancreas versus chronic pancreatitis: diagnostic dilemma with significant consequences // World J. Surg. 2003. Vol. 27. N 11. P. 1249-1257.
  24. Vandooren J., Van den Steen P. E., Opdenakker G. Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9): the next decade // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2013. Vol. 48. N 3. P. 222-272.
  25. Zhai L. L., Cai C. Y., Wu Y., Tang Z. G. Correlation and prognostic significance of MMP-2 and TFPI-2 differential expression in pancreatic carcinoma // Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015. Vol. 8. N 1. P. 682-691.

Новости

Партнеры