Появляется все больше данных о том, что модифицированные ЛПНП обладают более атерогенными свойствами, чем нативные липопротеиды ЛПНП [1]. Окислительная модификация индуцирует образование иммуногенных эпитопов в молекулах ЛПНП, что приводит к появлению специфических антител против них [5]. Окисленные ЛПНП (ОкЛПНП) способствуют активации макрофагов и внутриклеточному накоплению эфиров холестерина (ХС), оказывают цитотоксическое действие на эндотелиальные клетки, увеличивают тромбоцитарную активность, стимулируют миграцию и пролиферацию гладкомышечных клеток, тем самым инициируя развитие атеросклеротического процесса [4].
В связи с этим высказывается предположение, что содержание ОкЛПНП является более важным диагностическим маркером атеросклероза, чем таковое общего ХС и ЛПНП. ОкЛПНП считаются ключевым фактором локального воспаления и дестабилизации атеросклеротических бляшек. Доказана способность ОкЛПНП взаимодействовать с аутоантителами к ним, образуя иммунные комплексы, оказывающие дополнительное повреждающее действие на эндотелий.
В развитии и поддержании воспалительного процесса при атеросклерозе следует отметить и особо важную роль СРБ, который является высокочувствительным маркером воспаления и тканевой деструкции. Известна его способность связываться с ОкЛПНП и, накапливаясь в местах атеросклеротического поражения артерий, поддерживать системное и локальное хроническое воспаление, в связи с чем СРБ считается вторичным триггером обострения воспалительного процесса в бляшке [2, 3].
В 1983 г. была обнаружена новая форма СРБ, состоящая, в отличие от нативной формы, не из пентамеров, а из свободных мономеров СРБ. В настоящее время изучение роли мономерного СРБ (моноСРБ) в воспалительном ответе вызывает большой интерес, так как существующие данные свидетельствуют о том, что именно переход пентамерной формы СРБ в мономерную вызывает повышение концентрации компонентов воспалительного ответа, ускоряет агрегацию тромбоцитов и секрецию серотонина.
Следует признать, что имеющиеся в литературе данные о роли модифицированных ЛПНП и антител к ним в атеросклеротическом процессе зачастую противоречивы. Поэтому изучение данного вопроса остается актуальным, как и поиск средств воздействия на указанные показатели.
Цель исследования: оценить диагностическое значение определения содержания ЛПНП и Ig G, модифицированных малоновым диальдегидом и метилглиоксалем, у больных с коронарным атеросклерозом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование включили 80 мужчин в возрасте 28–68 лет, которых разделили на три группы. Первую группу составили 50 пациентов 45–68 лет с ангиографически документированным гемодинамически значимым (> 50%) стенозированием коронарного русла, вторую группу — 20 больных 45–68 лет с верифицированными при коронарной ангиографии начальными (≤ 50%) атеросклеротическими поражениями коронарных артерий (КА). В контрольную группу вошли 10 молодых (28–30 лет) практически здоровых добровольцев без клинических признаков ИБС. В таблице 1 представлена клиническая характеристика обследованных групп.
Таблица 1
Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование
Критериями исключения являлись острые инфекционные и воспалительные заболевания, постоянный прием НПВП или глюкокортикоидов, операция аортокоронарного шунтирования и эндоваскулярные вмешательства в анамнезе, перенесенные в течение последних 3 месяцев, инфаркт миокарда или ОНМК, хроническая почечная недостаточность, стенозы более 40% некоронарной локализации.
В лаборатории иммунохимии (руководитель — к. б. н. Е. Е. Ефремов) НИИ экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса (РКНПК) разработаны и апробированы методические подходы для определения следующих показателей:
-
ЛПНП человека, модифицированные малоновым диальдегидом (МДА-ЛПНП);
-
ЛПНП человека, модифицированные метилглиоксалем (МГ-ЛПНП);
-
IgG человека, модифицированные малоновым диальдегидом (МДА-IgG);
-
IgG человека, модифицированные метилглиоксалем (МГ-IgG);
-
моноСРБ.
В вышеназванной лаборатории проводилось качественное определение аутоантител к ЛПНП, МГ-ЛПНП, МДА-ЛПНП, МГ-IgG и МДА-IgG методом твердофазного ИФА с использованием моноклональных антител, предоставленных лабораторией клеточной инженерии (руководитель — к. б. н. Т. Н. Власик). Результаты были представлены в относительных единицах (R) как отношение сигнала исследуемой пробы (А450) к величине сигнала в отрезной точке (cut-off). Количественное определение моноСРБ проводилось «сэндвич»-методом твердофазного ИФА на спектрофотометре «УНИПЛАН» фирмы ЗАО «ПИКОН» (Россия) при длине волны 450 нм. Для определения использовался тест-набор «Имтест-СРБ-моно» фирмы OОО «Имтек» (Россия).
У всех обследованных измеряли уровни в крови ОкЛПНП и аутоантител к ним, а также ключевых липидных (общий ХС, ЛПВП, ЛПНП, триглицеридов — ТГ) и воспалительных (высокочувствительного СРБ (вчСРБ), ИЛ-6) биомаркеров атеросклероза.
Исследование содеражния вчСРБ в сыворотке крови проводили нефелометрическим методом на анализаторе белков крови «Беринг Нефелометр» (BN ProSpec, Dade Behring Marburg GmbH, Германия) с использованием реактивов фирмы Dade Behring. Уровень ИЛ-6 измеряли методом твердофазного хемилюминесцентного ИФА («сэндвич»-метод) на анализаторе IMMULITE 1000 (Siemens Diagnostics, США) с использованием реактивов фирмы IMMULITE. Концентрации ХС, ЛПНП, ЛПВП, ТГ определяли на многоканальном биохимическом анализаторе Architect C-800 (Abbott, США) с использованием ферментных наборов.
Математическая обработка полученных результатов проводилась с помощью пакета для статистического анализа данных Statistica 6. Количественные переменные описывали числом пациентов, верхним и нижним квартилями, медианой. Оцениваемые показатели имели непараметрическое распределение, поэтому для проведения корреляционного анализа использовался ранговый коэффициент Спирмена. Для определения статистической значимости различий количественных признаков при попарном межгрупповом сравнении применяли U-критерий Манна — Уитни, для множественного межгруппового сравнения использовали тест медиан и критерий Краскела — Уоллиса, статистическая значимость присваивалась при значении p < 0,05. Для сопоставления групп по качественным признакам применяли метод χ2, точный критерий Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В таблице 2 представлены данные множественного межгруппового сравнения исследованных показателей с использованием теста Краскела — Уоллиса.
Таблица 2
Множественное межгрупповое сравнение исследованных показателей, Me (LQ–UQ)
При дальнейшем попарном сравнении данных по методу Манна — Уитни выявлены статистически значимые различия. В группе с начальными изменениями КА при сравнении с группой со значимым стенозированием КА статистически значимо выше были уровни ХС (p = 0,03) и ЛПВП (p = 0,02), а при сравнении с группой здоровых добровольцев отмечали более высокое содержание ХС (p = 0,01), ЛПНП (p = 0,01) и ИЛ-6 (p = 0,001). В группе со значимым стенозированием КА при сравнении с группой здоровых лиц выявлены значимо более высокие уровни ЛПНП (p = 0,03), вчСРБ (p = 0,01) и ИЛ-6 (p = 0,001).
При множественном межгрупповом сравнении статистически значимой разницы между концентрациями сывороточных МДА-ЛПНП и МГ-ЛПНП во всех трех группах получено не было. Однако при попарном межгрупповом сравнении в группе здоровых добровольцев наблюдались значимо более высокие уровни MДA-IgG (р = 0,01) и МГ-IgG (р = 0,02) по сравнению с показателями группы с тяжелым стенозированием КА.
Как видно из рисунка 1, у всех участников отмечалась высокая корреляционная связь между уровнями МДА-ЛПНП и МГ-ЛПНП (r = 0,62; p = 0,0000), а также между концентрациями МДА-IgG и МГ-IgG (r = 0,79; p = 0,0000).
Рис. 1. Корреляционная связь между уровнями липопротеидов низкой плотности, модифицированных малоновым диальдегидом (МДА-ЛПНП) и метилглиоксалем (МГ-ЛПНП), и концентрациями иммуноглобулинов G, модифицированных малоновым диальдегидом (МДА-IgG) и метилглиоксалем (МГ-IgG)
Следует также отметить наличие умеренной корреляционной связи между уровнями МДА-ЛПНП, МГ-ЛПНП и содержанием МДА-IgG, МГ-IgG (табл. 3).
Таблица 3
Корреляционная связь между уровнями липопротеидов низкой плотности, модифицированных малоновым диальдегидом (МДА-ЛПНП) и метилглиоксалем (МГ-ЛПНП), и концентрациями иммуноглобулинов G, модифицированных малоновым диальдегидом (МДА-IgG) и метилглиоксалем (МГ-IgG)
Статистически значимых различий в концентрациях вчСРБ и ИЛ-6 у больных с различной степенью поражения КА не было. Но данные показатели были значимо выше у участников с коронарным атеросклерозом, чем у здоровых лиц (см. табл. 2). Значения моноСРБ во всех группах статистически значимых различий не имели, что вызывает интерес, т. к. была выявлена тесная корреляционная связь между уровнями моноСРБ и вчСРБ (r = 0,75; p = 0,0000) и умеренная корреляционная связь между концентрациями моноСРБ и ИЛ-6 (r = 0,45; p = 0,00003) (рис. 2).
Рис. 2. Корреляционная связь между уровнями мономерного С-реактивного белка (моноСРБ) и высокочувствительного С-реактивного белка (вчСРБ) и между концентрациями моноСРБ и интерлейкина 6 (ИЛ-6)
Обобщая результаты нашей работы, можно заключить, что уровни МДА-ЛПНП и МГ-ЛПНП не всегда отражают степень тяжести атеросклеротического процесса. Содержание МДА-ЛПНП и МГ-ЛПНП может не различаться у здоровых лиц и пациентов с тяжелым атеросклеротическим поражением коронарного русла, даже при наличии у последних более высоких уровней маркеров воспаления и показателей липидного профиля. Этот факт можно объяснить тем, что окислительная модификация ЛПНП в основном происходит в субэндотелиальном пространстве артериальной стенки, в связи с чем существует вероятность, что находящиеся в субэндотелии модифицированные ЛПНП просто не выявляются в общей циркуляции. Ранее сообщалось, что in vivo в кровотоке циркулируют модифицированные ЛПНП различной степени окисленности и с разным соотношением первичных и вторичных продуктов окисления [1], что также может затруднять определение модифицированных ЛПНП.
Тот факт, что в нашем исследовании у молодых здоровых лиц были выявлены более высокие уровни МДА-IgG и МГ-IgG, чем у больных ИБС с гемодинамически значимым стенозированием КА, наталкивает на мысль о роли состояния иммунной системы пациентов в иммунно-воспалительном ответе при атеросклерозе. То есть активность иммунных процессов у лиц старшего возраста, страдающих ИБС, может оказаться ниже, чем у молодых здоровых людей. Такая точка зрения базируется на том, что с возрастом происходит инволюция лимфоидной ткани, ее замещение соединительной и жировой тканями, что сопровождается нарушением иммуннокомпетентности, а также снижением гуморального и клеточного иммунного ответа на чужеродные антигены. Особенности возрастной динамики показателей иммунного статуса заключаются прежде всего в уменьшении общего числа Т- и В-лимфоцитов, изменении соотношения Т-хелперов и Т-супрессоров. Пролиферативная активность лимфоцитов при их стимуляции антигенами снижается, нарушается экспрессия рецепторов, отвечающих за межклеточные взаимодействия. Меняется уровень продукции цитокинов и сывороточных Ig.
Сотрудниками лаборатории иммунохимии НИИ экспериментальной кардиологии РКНПК высказывается мнение, что высокая лабильность молекулы ЛПНП затрудняет ее использование в качестве стандарта для иммуноферментных диагностикумов, в качестве более удобных объектов исследования предлагаются IgG. Известно, что молекулы сывороточных белков, таких как IgG, имеют большую физико-химическую стабильность, и их средняя концентрация в сыворотке крови на порядок выше, чем концентрация apоВ. В связи с этим, наряду с уже ставшим классическим методом определения модифицированных ЛПНП, предлагается разработка тестов для оценки IgG. Такое предложение кажется целесообразным, так как в нашем исследовании была выявлена статистически значимая умеренная корреляция между уровнями МДА-ЛПНП, МГ-ЛПНП и содержанием МДА-IgG, МГ-IgG. При трудностях с определением концентрации модифицированных ЛПНП не исключается возможность измерения уровня IgG в качестве альтернативного метода оценки процессов альдегидной модификации белков.
Анализ полученных нами данных также выявил тесную корреляцию между уровнями моноСРБ и вчСРБ и умеренную корреляция между концентрациями моноСРБ и ИЛ-6, что, несомненно, представляет интерес и подтверждает возможность использования диагностического теста моноСРБ в качестве маркера воспаления наряду с определением вчСРБ и ИЛ-6.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В нашем клиническом исследовании у больных со значимым атеросклеротическим поражением коронарного русла отмечали более низкие уровни IgG, модифицированных малоновым диальдегидом (МДА-IgG) и метилглиоксалем (МГ-IgG), чем у молодых здоровых лиц. Таким образом, полученные нами данные подтверждают мнение о том, что возраст, иммунный статус и скорость метаболических процессов пациентов могут влиять на содержание сывороточных МДА-IgG и МГ-IgG. А выявленная в нашем исследовании статистически значимая умеренная корреляции между уровнями ЛПНП, модифицированных малоновым диальдегидом и метилглиоксалем, и концентрациями МДА-IgG, МГ-IgG не исключает возможность использования модифицированных IgG наряду с модифицированными ЛПНП при изучении процессов альдегидной модификации белков.
Выражаем благодарность лаборатории клеточной инженерии Научно-исследовательского института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса (руководитель — к. б. н. Т. Н. Власик) за предоставленные моноклональные антитела.
