Криптоспоридиоз представляет собой протозойное заболевание с преимущественным поражением ЖКТ, клинически протекающее в форме гастроэнтеритов различной степени тяжести.
В настоящее время идентифицирован 31 вид криптоспоридий. Криптоспоридии являются одноклеточными паразитами, они широко распространены в природе, инфицируют диких и домашних животных, а также являются вторым по значимости (после ротавируса) этиологическим фактором острых кишечных инфекций (ОКИ) у человека. Доказано, что криптоспоридии вызывают наиболее тяжелые случаи диареи у детей в возрасте до 5 лет, нередко приводящие к летальному исходу [1].
Криптоспоридии имеют моноксенный цикл развития, протекающий в ЖКТ одного хозяина. Инфицирование человека происходит при заглатывании ооцист, из которых в тонком кишечнике высвобождаются спорозоиты, проникающие в щеточную каемку энтероцитов. Далее следуют повторяющиеся циклы спорогонии либо гаметогония с образованием ооцист. Повреждение стенки тонкого кишечника в результате жизнедеятельности паразита сопровождается такими клиническими симптомами, как частый водянистый стул, боль в животе, повышение температуры тела; позднее развивается синдром мальабсорбции [2].
Способность вызывать ОКИ у человека установлена для 20 видов криптоспоридий. Наиболее часто вспышки ОКИ и спорадические случаи диареи во всем мире сопряжены с инфицированием двумя видами криптоспоридий: Cryptosporidium hominis и C. parvum. Отдельные генотипы C. hominis
и C. parvum идентифицируют на основании секвенирования гликопротеина gp60. Последний является наиболее информативным генетическим маркером для генотипирования изолятов криптоспоридий [3].
Изучение распространенности криптоспоридиоза у ВИЧ-инфицированных лиц показало, что клиническое течение заболевания находится в зависимости от того, какие виды и генотипы возбудителя превалируют у пациента. Так, инфекция, вызванная C. hominis (генотипов Id и Ib), C. parvum, C. canis, C. felis, ассоциирована с более тяжелым клиническим течением криптоспоридиоза и характеризуется хронической диареей и значительной потерей массы тела [4]. Принимая во внимание зависимость клинической картины криптоспоридиоза от генотипического профиля возбудителя, а также различающуюся вирулентность генотипических вариантов криптоспоридий в отношении организма человека, следует отметить, что молекулярно-биологическая диагностика (генотипирование) паразита играет важную роль в определении риска тяжелого течения заболевания, развития осложнений, а также контагиозности инфекции для окружающих [5].
Цель исследования:
определение генотипов инфицирующих видов криптоспоридий, вызывающих острые кишечные инфекции у детей в возрасте до 5 лет, и установление особенностей клинического течения криптоспоридиоза в зависимости от генотипа возбудителя.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование являлось одномоментным. В него включали больных, госпитализированных в инфекционное отделение Медико-санитарной части № 2 (г. Томск). Анализ кала (выявление ооцист криптоспоридий, ПЦР) выполняли на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета (СибГМУ) Минздрава России (г. Томск).
Проведение работы одобрено этическим комитетом СибГМУ Минздрава России (протокол № 5123 от 27.12.2017).
Обследованы 98 детей в возрасте до 5 лет включительно, которые поступили в инфекционный стационар с марта по май 2017 г. Все дети были госпитализированы в порядке скорой медицинской помощи в связи с повышением температуры до 38–39 °C, жидким водянистым стулом от 3 до 10 раз в сутки, слабостью, снижением аппетита; в некоторых случаях отмечалась рвота. Родители (опекуны) всех обследованных пациентов после разъяснения в доступной для них форме информации об объемах и характере медицинских манипуляций, а также о возможных последствиях их проведения давали свое письменное согласие на участие ребенка в исследовании.
Материалом для исследования служил кал. Для концентрирования ооцист криптоспоридий применяли устройство одноразового использования Mini Parasep (Diasys Ltd, США). Приготовление препаратов осуществляли следующим образом: на обезжиренное предметное стекло наносили осадок, полученный после концентрирования кала, высушивали на воздухе; далее мазки окрашивали по Цилю — Нильсену (ЭКОлаб, Россия). Окрашенные препараты микроскопировали с иммерсионной системой на микроскопе Primo Star (Carl Zeiss, Германия). Ооцисты криптоспоридий, окрашенные по Цилю — Нильсену, имели вид округлых красных образований диаметром 3–5 мкм.
Выделение ДНК возбудителя проводили спиртовым преципитатным методом. Для разрушения ооцист использовали бусины silica-zir (BioSpec Products, США) различного диаметра. Количество выделенной ДНК, а также присутствие примесей определяли на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США).
Генотипирование криптоспоридий выполняли методом ПЦР. ДНК амплифицировали посредством ПЦР с применением флюорофора FAM и гасителя флюоресценции BHQ-1 на амплификаторе Mini Opticon (Bio-Rad, США). ПЦР проводили в объеме 25 мкл, реакционная смесь содержала буфер K25 (× 1), 0,2 mM dNTP, 300 nМ праймеров, 0,5 ед. акт. SmartTaq ДНК-полимеразы, блокированной антителами (Биолабмикс, Россия).
Использовали праймеры, позволяющие специфично амплифицировать фрагменты ДНК криптоспоридий:
1) C. parvum
(генотип IIaA15G2R1):
– Forward 5'-GAGGAAGGTAGTGAAGACGATG-3';
– Probe FAM-CCAGCTCAAAGTGAAGGCGCAAC-BHQ1;
– Reverse 5'-GGTGCATAGACGATAGTGTAGG-3';
2) C. hominis (генотип IbA10G2):
– Forward 5'-CCGTTATAGTCTCCGCTGTATTC-3';
– Probe FAM-TCTCCGCCATCTGCTTCTCTTGC-BHQ1;
– Reverse 5'-GCCACCTTGAGTATCTTGTCC-3'.
Для каждой пары праймеров были подобраны оптимальные режимы амплификации путем варьирования температуры отжига, состава амплификационного буфера, а также параметров амплификационного цикла.
Полученные результаты проанализированы при помощи пакета статистических программ SPSS 23.0 (IBM SPSS Statistics, США). Описание количественных показателей выполнено с указанием медианы (Me), 25-го и 75-го процентилей (25%; 75%), описание качественных показателей — с приведением абсолютной и относительной частоты встречаемости. Межгрупповое сравнение количественных показателей независимых выборок проводили с использованием критерия Краскела — Уоллиса, качественных показателей — с помощью критерия хи-квадрат (χ2) Пирсона. Для внутригруппового сравнения количественных показателей двух независимых выборок применяли U-критерий Манна — Уитни, качественных показателей — χ2 Пирсона с поправкой Бонферрони. Результаты считали статистически значимыми при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
У 26 (26,5%) из 98 детей, госпитализированных по поводу ОКИ, в фекалиях определялись ооцисты криптоспоридий. В результате ПЦР ДНК криптоспоридий, проведенной с использованием специфических праймеров, у 3 из 26 (11,5%) пациентов было установлено наличие возбудителей, относящихся к генотипу IbA10G2 C. hominis, у 10 (38,5%) детей — к генотипу IIaA15G2R1 C. parvum. В 13 (50,0%) образцах отсутствовали фрагменты ДНК, комплементарные подобранным праймерам к генотипам IbA10G2 C. hominis и IIaA15G2R1 C. parvum, генотип и вид криптоспоридий установить не удалось.
Для анализа особенностей клинического течения заболевания в зависимости от генотипа возбудителя все пациенты с криптоспоридиозом были разделены на три группы: первую группу составили больные, у которых были обнаружены C. hominis (генотип IbA10G2); вторую группу — больные, позитивные по C. parvum (генотип IIaA15G2R1); в третью группу вошли пациенты, инфицированные криптоспоридиями с иными генотипами. Дети первой группы были в возрасте 12 (n = 1) и 24 (n = 2) месяцев, второй группы — 12 (11,5; 24) месяцев, третьей — 36 (12; 42) месяцев. Первая группа состояла только из мальчиков, во вторую группу входили 5 (50,0%) девочек и 5 (50,0%) мальчиков, в третью — 8 (61,5%) девочек и 5 (38,5%) мальчиков. По возрасту группы не различались (р = 0,158).
В результате сравнительного анализа клинико-лабораторных показателей ОКИ, вызванной разными генотипами криптоспоридий, было установлено, что значения температуры тела, частота стула и общее количество лейкоцитов в крови у больных исследуемых групп статистически значимых различий не имеют. При этом СОЭ в группе детей, зараженных C. parvum, оказалась статистически значимо выше, чем у пациентов с неидентифицированным генотипом криптоспоридий (p = 0,036). По характеру течения заболевания группы различий не имели (табл.).
Таблица
Клинико-лабораторные особенности криптоспоридиоза у детей в зависимости от генотипа возбудителя и назначенное лечение
|
Показатели |
Группа 1 (n = 3) |
Группа 2 (n = 10) |
Группа 3 (n = 13) |
Межгрупповые различия |
Внутригрупповые различия |
| Число дефекаций* | 2; 3; 5 | 5 (2; 10) | 3 (2; 5) | p = 0,434 | – |
| Температура тела, °C* | 38,0; 38,5; 38,5 | 38,8 (38,3; 39,5) | 39,0 (38,0; 39,7) | p = 0,567 | – |
| Лейкоциты, × 109/л* | 6,0; 13,0; 14,1 | 13,3 (12,6; 17,0) | 9,3 (7,4; 15,1) | p = 0,117 | – |
| СОЭ, мм/ч* | 8; 10; 37 | 10,5 (8,0; 17,5) | 6,0 (4,5; 9,5) | p = 0,023 |
p1–3 = 0,082 p2–3 = 0,036 p1–2 = 0,864 |
| Волнообразное течение ОКИ, абс. (%) | 0 (0,0) | 1 (10,0) | 2 (15,4) | p = 0,740 | – |
| Повторная госпитализация, абс. (%) | 0 (0,0) | 0 (0,0) | 0 (0,0) | p = 1,000 | – |
|
Сопутствующие патогены, абс. (%) |
|||||
| Отсутствуют | 0 (0,0) | 2 (20,0) | 0 (0,0) | р = 0,121 |
p1–3 = 1,000 p2–3 = 0,092 p1–2 = 0,399 |
| Вирусы | 1 (33,3) | 1 (10,0) | 5 (38,5) |
p1–3 = 0,872 p2–3 = 0,128 p1–2 = 0,332 |
|
| Бактерии | 0 (0,0) | 5 (50,0) | 2 (15,4) |
p1–3 = 0,474 p2–3 = 0,070 p1–2 = 0,119 |
|
| Бактерии + вирусы | 2 (66,7) | 2 (20,0) | 6 (46,2) |
p1–3 = 0,532 p2–3 = 0,194 p1–2 = 0,129 |
|
| Назначенное лечение, абс. (%) | |||||
| Инфузионная терапия | 0 (0,0) | 2 (20,0) | 10 (76,9) | p = 0,006 |
p1–3 = 0,039 p2–3 = 0,021 p1–2 = 1,000 |
| Кишечные антисептики | 2 (66,7) | 6 (60,0) | 10 (76,9) | p = 0,680 | – |
| Антибиотики | 1 (33,3) | 8 (80,0) | 10 (76,9) | p = 0,253 | – |
| Противовирусные препараты | 1 (33,3) | 4 (40,0) | 4 (30,8) | p = 0,898 | – |
* В группах 2, 3 данные представлены в виде медианы, 25-го и 75-го процентилей.
Примечания.
1. Первая группа — C. hominis-позитивные пациенты; вторая группа — C. parvum-позитивные пациенты; третья группа — больные с неидентифицированным генотипом криптоспоридий.
2. ОКИ — острая кишечная инфекция.
Следует отметить, что в случае инфицирования детей криптоспоридиями, не относящимися к изучаемым генотипам,
для нормализации состояния пациентов статистически значимо чаще, чем при других этиологических вариантах криптоспоридиоза, приходилось прибегать к назначению инфузионной терапии (p < 0,05). Антибиотики и противовирусные препараты использовали с одинаковой частотой во всех группах больных (см. табл.).
ОБСУЖДЕНИЕ
Основным путем заражения криптоспоридиями является фекально-оральный путь. При этом передача возбудителя возможна в нескольких вариантах: от человека к человеку, от животного к человеку, а также при употреблении контаминированной воды и пищи. Эпидемиологические исследования показали, что для разных видов криптоспоридий тот или иной вариант передачи возбудителя является преимущественным. Так, C. hominis чаще передается от человека к человеку; для C. parvum и других видов криптоспоридий, являющихся возбудителями антропозоонозов, наиболее характерна передача от животного к человеку [6].
Существуют разные подходы к определению видов криптоспоридий: анализ сиквенса ДНК различных локусов; исследование множественных микросателлитных маркеров; анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных ДНК, изучение подвижности гетеродуплексов [7].
Показано, что ген gp60 является наиболее высокополиморфным участком ДНК из всех изученных на сегодняшний день кодирующих локусов криптоспоридий. Секвенирование gp60 выявило пять аллельных групп, проиндексированных как Ia, Ib, Ic, Id и II. Животные изоляты содержали аллель II типа, который также был идентифицирован в изолятах человека. Аллель гена gp60 I типа содержался только в человеческих изолятах криптоспоридий [8].
В нашем исследовании для генотипирования криптоспоридий использовались специфические праймеры к генотипам возбудителей IIaA15G2R1 и IbA10G2, которые вызывают заболевание у детей в возрасте до 5 лет. Было установлено, что только у 3 из 26 (11,5%) детей, больных криптоспоридиозом, заболевание вызвано генотипом IbA10G2 C. hominis. Между тем данные литературы свидетельствуют о том, что C. hominis является наиболее распространенным видом паразита, детектируемым у человека, в частности у детей первых лет жизни и у женщин в возрасте от 15 до 45 лет [9]. Данный вид широко распространен в экономически развивающихся странах, включая Индию, Бразилию, Пакистан и Перу [10–12]. Показано также, что генотипы криптоспоридий Ia, Ib, Id и Ie вызывают ОКИ у людей чаще всего, при этом наибольшая гетерогенность характерна для Перу, Малайзии и Индии. Вирулентный генотип Ib ответственен за большинство вспышек криптоспоридиоза по всему миру. Бо’льшая часть вспышек криптоспоридиоза в США ассоциирована с генотипом IbA10G2, который также вызывал эпидемии криптоспоридиоза в Европе [9].
В индустриальных странах, таких как Австралия, США, страны Европы, C. hominis встречается с той же частотой, что и C. parvum, при этом на Ближнем Востоке C. parvum доминирует над другими видами криптоспоридий у пациентов с криптоспоридиозом [13]. Два основных генотипа C. parvum — IIaA15G2R1 и IIaA18G3R1 — наиболее часто вызывали криптоспоридиоз в Португалии, Нидерландах и Ирландии [14]. В экономически развивающихся странах, включая Индию, Малайзию, Уганду, Кению, были обнаружены генотипы IIb и IIe [9].
Предполагают, что между видами и генотипами криптоспоридий часто происходят генетические рекомбинации, что, в свою очередь, приводит к возникновению более трансмиссивных и вирулентных вариантов возбудителя. Так, например, установлено, что благодаря генетическим рекомбинациям появился гипертрансмиссионный генотип IIaA15G2R1, вызывавший вспышки криптоспоридиоза в США, Канаде, Великобритании и Испании [15].
Результаты проведенного нами исследования показали, что у 10 из 26 (38,5%) обследованных пациентов с криптоспоридиозом заболевание было вызвано C. parvum (генотип IIaA15G2R1). Значения СОЭ, характеризующие выраженность системного воспалительного ответа на паразитарную инвазию, оказались выше в группе детей, зараженных C. parvum. Однако к назначению инфузионной терапии для борьбы с дегидратацией чаще приходилось прибегать в случае инфицирования криптоспоридиями, не относившимися к генотипам IIaA15G2R1 C. parvum и IbA10G2 C. hominis.
Существует несколько других видов криптоспоридий, таких как C. meleagridis, C. canis и C. felis, которые ассоциированы с ОКИ у человека. Установлено, что они широко распространены в экономически развивающихся странах [9]. Криптоспоридиоз, ассоциированный с C. cervine, напротив, чаще регистрируется в индустриальных странах, включая Канаду, Великобританию и США [9].
В нашем исследовании у 13 из 26 (50,0%) обследованных пациентов возбудители не относились ни к генотипу IIaA15G2R1 C. parvum, ни к генотипу IbA10G2 C. hominis (указанные генотипы не определялись применявшимися при амплификации ДНК праймерами). Вероятно, в этом случае главными этиологическими факторами криптоспоридиоза оказались другие вирулентные генотипы C. parvum и C. hominis либо иные, менее распространенные, виды криптоспоридий.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Принимая во внимание зависимость клинической картины и особенностей течения криптоспоридиоза от генотипической принадлежности инфицирующего вида возбудителя, следует подчеркнуть важность применения молекулярно-генетических методов диагностики в практическом здравоохранении с целью ранней верификации наиболее вирулентных этиологических вариантов криптоспоридиоза, своевременного проведения профилактики, этиотропной и патогенетической терапии.
Исследование выполнено на средства гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых (договор № 14W01.17.3455-МД).
