Научно-практический медицинский рецензируемый журналISSN 1727-2378
Ru
En

Применение метода «Тромбориск» для оценки гемостаза у детей с тромбозом глубоких вен

Библиографическая ссылка: Жарков П. А., Полетаев А. В., Грачёва М. А., Серёгина Е. А. и др. Применение метода «Тромбориск» у детей с тромбозом глубоких вен // Доктор.Ру. Гематология. 2016. № 5 (122). С. 48–51.
Применение метода «Тромбориск» для оценки гемостаза у детей с тромбозом глубоких вен
3 Мая 03:51

Цель исследования: определение чувствительности и специфичности теста «Тромбориск» при нарушениях в системе протеина С у детей с тромбозом глубоких вен на фоне терапии злокачественных новообразований.

Материалы и методы. Проспективным методом набрана когорта пациентов в возрасте 1–16 лет (n = 30). Проведен комплекс исследований: определение активности протеина С, концентрации свободного протеина S, волчаночного антикоагулянта (с ядом гадюки Рассела и с кварцевым активатором) и резистентности к активированному протеину С (РАПС), а также тест «Тромбориск».

Результаты. Чувствительность теста «Тромбориск» составила 78%, специфичность — 71%, прогностическая ценность положительного результата — 90%, отрицательного результата — 50%. Коэффициент корреляции Спирмена между значением теста «Тромбориск» и активностью протеина С составил 0,47 (*Р = 0,03), концентрацией свободного протеина S — 0,18 (Р = 0,42) и РАПС — 0,53 (*Р = 0,01).

Заключение. Тест «Тромбориск» — чувствительный и эффективный инструмент, применимый для скрининга нарушений в системе протеина С у детей с тромбозом глубоких вен.

Грачёва Марина Андреевна — научный сотрудник лаборатории биофизики ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. 117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1. E-mail: gerus.marina@gmail.com

Жарков Павел Александрович — к. м. н., врач-гематолог консультативно-поликлинического отделения ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. 117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1. E-mail: pzharkoff@gmail.com

Полетаев Александр Владимирович — врач клинической лабораторной диагностики, руководитель группы клинического гемостаза ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. 117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1. E-mail: poletaev_alexandr@mail.ru

Пшонкин Алексей Вадимович — врач-гематолог, заведующий стационаром кратковременного лечения ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. 117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1. E-mail: alexey.pshonkin@gmail.com

Серёгина Елена Александровна — научный сотрудник группы клинического гемостаза ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. 117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1. E-mail: elsereg@inbox.ru

Как показано ранее, распространенность венозных тромбозов (ВТ) у детей невысока и не превышает 1 : 10 000 детей в год [3, 5, 12]. Тем не менее, по данным крупного эпидемиологического исследования, выполненного в США, в период с 2001 по 2007 г. количество ВТ у детей возросло почти в 2 раза [7]. Это увеличение в разной степени наблюдается во всех возрастных группах и среди пациентов подросткового возраста достигает 94 : 10 000 обращений, приближаясь к значениям, известным для взрослых пациентов [7, 13]. В большинстве случаев это вторичные окклюзии, возникающие на фоне травм, обширных хирургических вмешательств, наличия центрального венозного катетера, септических состояний или злокачественных новообразований (ЗН) [3, 57, 12]. Так, частота ВТ у детей с ЗН крови превышает 10% и достигает 16% среди детей, получающих терапию по поводу острого лимфобластного лейкоза [2].

Формирование ВТ — всегда комплексный процесс, зависящий как от «внутренних» причин (таких как особенности системы свертывания крови и сосудистой стенки), так и от внешних воздействий на организм ребенка. Особого внимания в патогенезе ВТ у детей заслуживает тромбофилия — состояние повышенной склонности к тромбозам. В настоящее время у детей доказана роль следующих маркеров тромбофилии: дефицита естественных антикоагулянтов (протеина С, S, антитромбина), персистенции волчаночного антикоагулянта (ВА) или антифосфолипидных антител, гипергомоцистеинемии и гиперлипопротеинемии по липопротеину (а), а также носительства полиморфизмов FV-Лейден и FII G20210A [14]. Большинство этих маркеров относится к системе протеина С или является ее частью. Поскольку исследование полной панели данных тестов, как правило, длительно, дорого и не всегда оправданно, то необходимы скрининговые тесты, позволяющие заподозрить те или иные проявления тромбофилии в организме ребенка. Одним из таких тестов является «Тромбориск» (HemosIL ThromboPath, Instrumentation Laboratory, США). Данный метод основан на способности эндогенного протеина С, активированного с помощью вещества Protac (экстракта змеиного яда щитомордника — Agkistrodon contortrix), ингибировать генерацию тромбина, индуцированную тканевым тромбопластином. Количество выработанного тромбина оценивают по изменению оптической плотности (ОП), измеренной при длине волны 405 нм в присутствии (А) и в отсутствие (В) Protaс с помощью специфичного к тромбину хромогенного субстрата.

У взрослых пациентов этот метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью [9], однако диагностическая значимость данного теста у детей до сих пор не исследована.

Цель исследования: определение чувствительности и специфичности теста «Тромбориск» при нарушениях в системе протеина С у детей с тромбозом глубоких вен (ТГВ) на фоне терапии ЗН.


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проспективным методом была набрана группа пациентов в возрасте 1–16 лет (n = 30) с объективно подтвержденным ТГВ, которым проводили лечение ЗН в условиях стационара ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева». До начала антикоагулянтной терапии выполнен забор венозной крови в стандартные вакуумные пробирки с 3,2%-м (0,106 М раствором цитрата натрия (Monovette Sarstedt, Германия, 3 мл). После центрифугирования (1,500 g, 15 минут, центрифуга Thermo Scientific Labofuge 400, Германия) плазма крови была отобрана во вторичные пробирки и заморожена (–80 °С). В день исследования образцы плазмы крови размораживали на водяной бане при 37 °С в течение 5 минут. Проведен комплекс исследований: определение активности протеина С (HemosIL Protein C), концентрации свободного протеина S (HemosIL Free Protein S), волчаночного антикоагулянта с ядом гадюки Рассела — ВАЯГР (HemosIL dRVVT screen, HemosIL dRVVT confirm) и с кварцевым активатором — ВАКА (HemosIL Silica Clotting Time), резистентности к активированному протеину С — РАПС (HemosIL Factor V Leiden (APCTM Resistance V)), а также тест «Тромбориск» (HemosIL ThromboPath).

Результаты теста «Тромбориск» выражали в процентах Protac-индуцированного ингибирования свертывания (Protac-induced сoagulation inhibition — PiCi%) и вычисляли по формуле:


PiCi% = [(B – A)/B] × 100,


где А и В — значения ОП тестируемой плазмы крови с Protac (A) и без него (В).

Снижение PiCi% свидетельствует о нарушениях антикоагулянтного пути протеина С, а также может быть связано с наличием РАПС, снижением концентрации протеина S и присутствием ВА [9].

За положительный результат теста «Тромбориск» принята величина менее 82,5% PiCi. Активность протеина С и концентрацию свободного протеина S считали пониженными при значениях соответствующих тестов менее 70%, за наличие РАПС принято значение менее 2,2. За положительное значение ВАЯГР и ВАКА принимали показатель более 1,2. Все измерения проведены на автоматическом коагулометре ACL TOP 700 (Instrumentation Laboratory, США).

Чувствительность, специфичность, прогностическую ценность положительного и отрицательного результатов, а также диагностическую значимость теста «Тромбориск» при нарушениях в системе протеина С определяли с помощью стандартных методик [1]. Для оценки корреляций результата теста «Тромбориск» с активностью протеина С и концентрацией свободного протеина S, а также РАПС использовали коэффициент Спирмена (КС). Статистический анализ проведен с применением программного пакета OriginPro 8.0 (Microcal Software, Нордхэмптон, США).


РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе исследования снижение активности протеина С зарегистрировано у 13 пациентов, концентрации свободного протеина S — у 13, положительный тест на ВАЯГР — у 2 пациентов (определяли у 29 пациентов), ВАКА — у 7 (определяли у 29 пациентов), РАПС выявлена у 2 детей. То или иное нарушение определено у 23 больных. Положительное значение теста «Тромбориск» обнаружено у 21 ребенка, при этом в 18 случаях это соответствовало изменениям в системе протеина С (табл. 1).


Таблица 1

Демографические данные и результаты лабораторных тестов обследованных пациентов

8_1.jpg

Примечание: нд — нет данных; отр — отрицательный результат; пол — положительный результат.



Таким образом, истинно положительные результаты теста «Тромбориск» получены в 18 случаях, ложноположительные — в 2, ложноотрицательные — в 5 и истинно отрицательные — в 5 случаях. Чувствительность метода составила 78%, специфичность — 71%, прогностическая ценность положительного результата — 90%, а отрицательного результата — 50%.

Чувствительность и специфичность теста к изменениям отдельных показателей системы протеина С представлена в таблице 2.


Таблица 2

Основные параметры теста «Тромбориск» по отношению к нарушениям в системе протеина С

8_2.jpg

Примечание. ИП — истинно положительные результаты; ЛП — ложноположительные результаты; ЛО — ложноотрицательные результаты; ИП — истинно отрицательные результаты; ЧМ — чувствительность метода; СМ — специфичность метода; ПЦПР — прогностическая ценность положительного результата; ПЦОР — прогностическая ценность отрицательного результата.



Выявлены слабые корреляции между лабораторными тестами: КС между результатом теста «Тромбориск» и активностью протеина С (рис. 1) составил 0,47 (р = 0,03), для корреляции между значением теста «Тромбориск» и РАПС (рис. 2) КС = 0,53 (р = 0,01). Корреляции между результатом теста «Тромбориск» и концентрацией свободного протеина S не наблюдалось: КС = 0,18 (р = 0,42). Корреляционный анализ проводили по данным 21 пациента с отрицательными значениями ВАЯГР и ВАКА.


Рис. 1. Корреляция между результатами теста «Тромбориск» и активностью протеина С

r8_1.jpg

Рис. 2. Корреляция между результатами теста «Тромбориск» и резистентностью к активированному протеину С.

Примечание: о. е. — относительные единицы

r8_2.jpg

ОБСУЖДЕНИЕ

По нашим данным, это первое исследование, посвященное применению теста «Тромбориск» у детей с ТГВ на фоне ЗН. Чувствительность и специфичность данного теста к нарушениям в системе протеина С у взрослых пациентов хорошо изучены. Кроме того, в настоящее время получены результаты использования этого теста как интегрального показателя баланса про- и антикоагулянтов у пациентов с циррозом печени [11], у женщин при нормально [8] и патологически [4] протекающей беременности.

Как показано на основании мультицентрового исследования, «Тромбориск» обладает 100%-й чувствительностью к нарушениям в системе протеина С. Чувствительность данного метода к присутствию ВА, дефициту протеина С или протеина S несколько ниже и составляет 97,5%, 95,0% и 87,1% соответственно [9]. Специфичность метода также более чем удовлетворительная: положительное значение теста «Тромбориск» при отсутствии изменения активности протеинов С и S, ВА или FV-Лейден отмечено только у 13,6% пациентов [9]. Нами получены сходные результаты, однако чувствительность теста к сниженной активности протеинов С и S была немного ниже.

Таким образом, данный тест обладает высокой чувствительностью (78%) и достаточной специфичностью (71%) для скрининга нарушений в системе протеина С у детей с ТГВ на фоне терапии ЗН. Интересно, что в нашем случае значение чувствительности, особенно к сниженной активности протеина С или концентрации свободного протеина S, несколько ниже такового в группах взрослых пациентов. Нельзя исключить связь этой ситуации с относительно небольшим размером нашей выборки. Кроме того, мы не проводили валидации значений теста «Тромбориск» на выборке здоровых добровольцев, а использовали стандартное значение менее 82,5%, рекомендованное производителем.

Особого внимания заслуживают положительные значения теста, позволяющие выявить те или иные нарушения в системе протеина С с вероятностью 0,9. Несмотря на продемонстрированные статистически значимые корреляции значения теста «Тромбориск» с активностью протеина С и значением РАПС, корреляции между результатами теста «Тромбориск» и концентрацией свободного протеина S не наблюдалось (КС = 0,18; р = 0,42). Поскольку протеин S является кофактором протеина С и не оказывает прямого антикоагулянтного действия, то можно предположить, что снижение концентрации свободной формы данного белка уменьшает генерацию тромбина нелинейно, что также отражается на результатах теста «Тромбориск».

Интересна и прогностическая роль данного теста. Если применение глобального метода оценки нарушений в системе протеина С относительно риска ВТ у взрослых может быть оправданно [10], то у детей предсказательная сила положительных значений теста в отношении ВТ до сих пор неизвестна. С экономической точки зрения, вероятно, прямые затраты на проведение данного теста ниже ожидаемых при проведении всей панели исследований системы протеина С (активность протеина С, концентрации свободного протеина S, РАПС, ВА). В нашем исследовании те или иные нарушения в системе протеина С выявлены у 21 из 30 пациентов, однако, как видно из таблицы 1, чаще всего снижение активности протеина С и концентрации свободного протеина S было неглубоким, а подавляющее большинство положительных результатов теста на ВА получены при исследовании с кварцевым активатором. Роль незначительного снижения активности протеинов С и S в формировании тромбозов у детей с ЗН до сих пор освещена недостаточно, и, учитывая относительно низкую распространенность тромбозов у детей, обоснованность применения данного теста с прогностической целью в общей популяции представляется сомнительной. Кроме того, для любого теста необходима внутрилабораторная валидация.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, на основании полученных результатов можно считать тест «Тромбориск» чувствительным и эффективным инструментом, применимым для скрининга нарушений в системе протеина С у детей с тромбозом глубоких вен, возникшим на фоне терапии злокачественного новообразования. Прогностическая роль данного метода применительно к педиатрическому тромбозу остается неизученной, и для ее выяснения необходимы дальнейшие исследования.


Применение метода «Тромбориск» для оценки гемостаза у детей с тромбозом глубоких вен
3 Мая 03:51
ЛИТЕРАТУРА
  1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.
  2. Жарков П. А., Грачева М. А., Ройтман Е. В., Феоктистова Е. В. и др. Распространенность тромбозов глубоких вен у детей с онкогематологической патологией // Тромбоз, гемостаз и реология. 2015. № 3 (63). С. 29–34.
  3. Andrew M., David M., Adams M., Ali K. et al. Venous thromboembolic complications (VTE) in children: first analyses of the Canadian Registry of VTE // Blood. 1994. Vol. 83. N 5. P. 1251–1257.
  4. Ferroni P., La Farina F., Palmirotta R., Martini F. et al. Predictive value of thrombopath determination in women with infertility and pregnancy complications // Clin. Chim. Acta. 2010. Vol. 411. N 1–2. P. 37–42.
  5. Nowak-Göttl U., von Kries R., Göbel U. Neonatal symptomatic thromboembolism in Germany: two year survey // Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal Ed. 1997. Vol. 76. N 3. F. 163–167.
  6. O'Brien S. H., Klima J., Termuhlen A. M., Kelleher K. J. Venous thromboembolism and adolescent and young adult oncology inpatients in US children's hospitals, 2001 to 2008 // J. Pediatr. 2011. Vol. 159. N 1. P. 133–137.
  7. Raffini L., Huang Y. S., Witmer C., Feudtner C. Dramatic increase in venous thromboembolism in children's hospitals in the United States from 2001 to 2007 // Pediatrics. 2009. Vol. 124. N 4. P. 1001–1008.
  8. Smirnov M., Cao Z., Diaz D., Triscott M. HemosIL ThromboPath: a global assay sensitive to procoagulant shift in hemostasis with pregnancy progression // 19th International Conference on Thrombosis. Tel Aviv, 2006.
  9. Toulon P., Smirnov M., Triscott M., Safa O. et al. A new chromogenic assay (HemosIL ThromboPath) is sensitive to major prothrombotic risk factors affecting the protein C pathway. Results of a multicenter study // Thromb. Res. 2009. Vol. 124. N 1. P. 137–143.
  10. Tripodi A., Legnani C., Lemma L., Cosmi B. et al. Abnormal Protac-induced coagulation inhibition chromogenic assay results are associated with an increased risk of recurrent venous thromboembolism // J. Thromb. Thrombolysis. 2010. Vol. 30. N 2. P. 215–219.
  11. Tripodi A., Primignani M., Lemma L., Chantarangkul V. et al. Detection of the imbalance of procoagulant versus anticoagulant factors in cirrhosis by a simple laboratory method // Hepatology. 2010. Vol. 52. N 1. P. 249–255.
  12. Van Ommen C. H., Heijboer H., Büller H. R., Hirasing R. A. et al. Venous thromboembolism in childhood: a prospective two-year registry in the Netherlands // J. Pediatr. 2001. Vol. 139. N 5. P. 676–681.
  13. White R. H. The epidemiology of venous thromboembolism circulation. 2003. Vol. 107. N 23. Suppl. 1. P. S14–18.
  14. Young G., Albisetti M., Bonduel M., Brandao L. et al. Impact of inherited thrombophilia on venous thromboembolism in children: a systematic review and meta-analysis of observational studies // Circulation. 2008. Vol. 118. N 13. P. 1373–1382.

Партнеры