Научно-практический медицинский рецензируемый журналISSN 1727-2378
Ru
En

Исследование хромосомной патологии в клетках неразвивающегося хориона методом высокопроизводительного секвенирования

Библиографическая ссылка: Глинкина Ж. И., Курцер М. А., Будник И. В. Исследование хромосомной патологии в клетках неразвивающегося хориона методом высокопроизводительного секвенирования // Доктор.Ру. 2017. № 7 (136). С. 43–45.
Исследование хромосомной патологии в клетках неразвивающегося хориона методом высокопроизводительного секвенирования
20 Июля 12:45
Ж.И. Глинкина, М.А. Курцер, И.В. БудникПеринатальный медицинский центр «Мать и дитя», г. Москва

Цель исследования: определить частоту и структуру хромосомных нарушений методом высокопроизводительного секвенирования (next­generation sequencing — NGS) в клетках хориона при неразвивающейся беременности.

Материалы и методы. От женщин с неразвивающейся беременностью в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст — 34,3 года) были получены и исследованы 197 образцов хориона и 2 образца ткани мышцы плода. Диагностику проводили методом NGS. Контрольным материалом служили клетки хориона с известной патологией, полученные хирургическим путем в ходе прерывания беременности по желанию пациентки.

Результаты. Хромосомная патология была обнаружена в 122 (61,3%) образцах из 199. Анеуплоидия по одной хромосоме имела место в 100 (82,0%) наблюдениях, патология с вовлечением двух хромосом — в 7 (5,7%), триплоидный набор — в 9 (7,4%), сочетание анеуплоидии с мозаицизмом — в 6 (4,9%). Наибольшей была доля трисомии хромосом — 76%. Моносомии в основном были представлены отсутствием одной из половых хромосом. Чаще патологические изменения наблюдали по 16, 22 хромосомам и одной из половых хромосом.

Заключение. NGS является высокоэффективным современным методом диагностики анеуплоидий и может быть предложено не только для исследования клеток неразвивающегося хориона, но и в качестве профилактического метода при проведении пренатальной диагностики.

Ключевые слова: next­generation sequencing, высокопроизводительное секвенирование, невынашивание беременности, неразвивающаяся беременность.

Глинкина Жанна Ивановна — д. б. н., заведующая лабораторией молекулярной генетики ПМЦ «Мать и дитя». 117209, г. Москва, Севастопольский пр­т, д. 24, кор. 1. E­mail: janna435@yandex.ru

Курцер Марк Аркадьевич — академик РАН, д. м. н., профессор, директор филиала МД МЕДИКАЛ ГРУПП ИНВЕСТМЕНТС ПЛС (ГК «Мать и дитя»). 117209, г. Москва, Севастопольский пр­т, д. 24, кор. 1. E­mail: m.kurtser@mcclinics.ru

Будник Ирина Васильевна — д. м. н., заведующая отделением гинекологии ПМЦ «Мать и дитя». 117209, г. Москва, Севастопольский пр­т, д. 24, кор. 1. E­mail: irina_budnik@bk.ru

Частота невынашивания желанных беременностей в популяции на протяжении многих лет составляет 15–25% [1–3]. Одним из методов исследования причин неразвивающейся беременности при невынашивании является изучение кариотипа плода. В настоящее время знания о хромосомном наборе абортусов после спонтанного прерывания беременности могут быть полезными при выборе последующей тактики лечения таких пациенток.
Чаще всего (75–80%) прерывание беременности происходит в I триместре. В основе невынашивания беременности в этих случаях могут лежать как генетические отклонения в эмбрионе, так и многоплодие, хронические инфекции, анатомические особенности матки, гормональные нарушения и т. д.
По данным литературы, в популяции до 50–60% ранних выкидышей связаны с хромосомными аномалиями. Многие авторы утверждают, что спонтанные аборты до 12 недель беременности являются хорошим индикатором генетических нарушений в эмбрионе [4–8]. Несмотря на то что к настоящему времени проведена серия масштабных цитогенетических исследований клеток спонтанных абортусов, существует ряд данных, противоречащих друг другу, касающихся частоты и спектра хромосомных нарушений у эмбрионов при неразвивающейся беременности.
Молекулярные методы исследования хромосомной патологии в различных тканях находят все более широкое применение в диагностике [5]. Это связано с тем, что при их использовании нет необходимости культивировать клетки. Классическим цитогенетическим методом не всегда удается получить результат. Зачастую это связано с низкой пролиферацией или ее отсутствием в исследуемых клетках.
Цель исследования: определить частоту и структуру хромосомных нарушений методом высококопроизводительного секвенирования (next­generation sequencing — NGS) в клетках хориона при неразвивающейся беременности.

Материалы и методы
Контрольным материалом служили клетки хориона с известной патологией (была проведена предварительная пренатальная диагностика), полученные хирургическим путем в ходе прерывания беременности по желанию пациентки. Во всех случаях результаты цитогенетического исследования совпали с результатами секвенирования. Образцы, полученные от женщин с неразвивающейся беременностью, доставляли в лабораторию в изотоническом физиологическом растворе при температуре +4 °С.
Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из клеток хориона или мышцы плода. Всего были исследованы 197 образцов хориона и 2 образца ткани мышцы плода, полученные от женщин в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст — 34,3 года). Пять образцов проанализировали дополнительно из высушенного хориона на специализированных картах для сбора биологических образцов производства компании «АлкорБио», г. Санкт­Петербург (карта представлена на рисунке 1, результаты — на рисунке 2). Средний срок прерывания беременности составил 8,5 ± 2,1 недели (от 5 до 16 недель).

Рис. 1. Расположение хориона на специализированной карте для хранения биологического материала. Здесь и далее в статье фото авторов
r7_1.jpg 

Рис. 2. Результат исследования клеток неразвивающегося хориона, взятого из физического раствора (А) и высушенного на специализированной карте (Б). Выявлена трисомия 16 хромосомы
r7_2.jpg 

ДНК из клеток получали стандартным методом выделения ДНК наборами компании Promega (США). Секвенирование проводили согласно технологии Illumina на приборе Miseq. Полученные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения BlueFluse Multi.

Результаты
Хромосомная патология была обнаружена в 122 (61,3%) образцах из 199. Частота встречаемости патологии у женщин разного возраста приведена в таблице.

Таблица
Частота хромосомной патологии в клетках хориона и мышцы плода у женщин различных возрастных групп
7_1.jpg 

Анеуплоидия по одной хромосоме была обнаружена в 100 (82,0%) наблюдениях, патология с вовлечением двух хромосом — в 7 (5,7%), триплоидный набор — в 9 (7,4%), сочетание анеуплоидии с мозаицизмом — в 6 (4,9%).
По частоте встречаемости трисомия хромосом заняла лидирующее место — 76%. Моносомии в основном были представлены отсутствием одной из половых хромосом (15 наблюдений). Только в одном наблюдении моносомия была представлена 21 хромосомой (рис. 3).

Рис. 3. Структура хромосомной патологии, выявленной методом высокопроизводительного секвенирования
r7_3.jpg 

Дупликации/делеции (рис. 4) и мозаицизм были выявлены в одинаковом количестве — 4%. Наиболее часто патологические изменения наблюдались по 16, 22 хромосомам и одной из половых хромосом (20%, 12,9% и 17,1%, соответственно).

Рис. 4. Результаты исследования клеток неразвивающегося хориона. Выявлены четыре копии короткого плеча 4 хромосомы (А), трисомия 22 хромосомы (Б), отсутствие генетического материала, соответствующего одной из половых хромосом (В)
r7_4.jpg 

Обсуждение
Результаты проведенного исследования показали, что хромосомные нару­шения плода обнаружены у 72,0% женщин старше 40 лет. Высокий процент генетической патологии у этой категории пациенток отмечен и другими авторами [4, 5]. Сравнение кариотипа у абортусов женщин различных возрастных групп показало увеличение частоты хромосомной патологии в зависимости от возраста женщин. Т. В. Золотухина и соавт. (2003) также отметили данную зависимость [9].
Согласно результатам анализа, у пациенток 20–30 лет преобладали абортусы с нормальным кариотипом, 31–40 лет — плоды с хромосомными аберрациями, у женщин старше 40 лет все плоды имели аномальный кариотип.

В другом исследовании сделано заключение, что у 82% пациенток старше 40 лет потеря беременности может быть связана с изменениями в кариотипе эмбриона [3].
Небольшое количество выявленных моносомий указывает на то, что эмбрионы с такой патологией имеют низкий потенциал развития. В структуре моносомий отсутствие одной из половых хромосом занимает почти 100%.

Анеуплоидии в клетках хориона одновременно по двум хромосомам, делеции/дупликации встречались достаточно редко, это тоже свидетельствует, что данная патология может оказывать негативное влияние на потенциал развития эмбриона.

Полученные данные показывают, что необходимо обращать внимание на возраст пациенток при планировании беременности, как при естественном зачатии, так и при проведении программы ВРТ. Женщинам с бесплодием старше 35 лет следует предлагать проведение программы ЭКО с предимплантационным скринингом эмбрионов на анеуплоидии. Перенос одного здорового эмбриона не только позволит родить ребенка без патологии, но и предупредить прерывание беременности больным плодом, которое может негативно сказаться на физическом и психическом здоровье женщины.

Идентичные профили при исследовании свежего и высушенного на карте материала, полученные нами однозначные данные говорят о том, что клетки высушенного хориона на карте для хранения биологического материала не влияют на результат анализа и карты возможно использовать для хранения материала в тех случаях, когда невозможна его транспортировка в ближайшее время.

Заключение
Исследование клеток неразвивающегося хориона вносит большой вклад в понимание процесса мейоза и, что немаловажно, может способствовать разработке профилактических мероприятий по предотвращению невынашивания беременности как при естественном зачатии, так и в рамках программы ВРТ.
На основании полученных результатов можно сделать заключение, что высокопроизводительное секвенирование (next­generation sequencing) является высокоэффективным современным методом диагностики анеуплоидий и может быть предложено не только для исследования клеток неразвивающегося хориона, но и в качестве профилактического метода при проведении пренатальной диагностики.

Исследование хромосомной патологии в клетках неразвивающегося хориона методом высокопроизводительного секвенирования
20 Июля 12:45
ЛИТЕРАТУРА
  1. Тишкевич О. Л., Жуковская С. В., Шелег С. Б., Илькевич Н. Е., Малышева Е. В., Семенов А. В. и др. Невынашивание беременности после ЭКО и ЭКО/ИКСИ. Пробл. репродукции. 1998; 6: 21. [Tishkevich O. L., Zhukovskaja S. V., Sheleg S. B., Il'kevich N. E., Malysheva E. V., Semenov A. V. i dr. Nevynashivanie beremennosti posle JeKO i JeKO/IKSI. Probl. reprodukcii. 1998; 6: 21. (in Russian)]
  2. Gissier M., Silverio M. M., Heminki E. In­vitro fertilisation pregnancies perinatal health in Finland 1991–1993. Hum. Reprod. 1995; 10(7): 1856–61.
  3. Spandorfer S. D., Davis O. K., Barmat L. I., Chung P. H., Rosenwaks Z. Relationship between maternal age and aneuploidy in in vitro fertilization pregnancy loss. Fertil. Steril. 2004; 81(5): 1265–9.
  4. Page J. M., Silver R. M. Genetic causes of recurrent pregnancy loss. Clin. Obstet. Gynecol. 2016; 59(3): 498–508.
  5. Sahoo T., Dzidic N., Strecker M. N., Commander S., Travis M. K., Doherty C. et al. Comprehensive genetic analysis of pregnancy loss by chromosomal microarrays: outcomes, benefits, and challenges. Genet. Med. 2017; 19(1): 83–9.
  6. Назаренко С. А., Суханова Н. Н., Лебедев И. Н., Никитина Т. В., Саженова И. А. Структура хромосомных нарушений у 552 спонтанных абортусов томской популяции. Молекулярно­биологические технологии в медицинской практике. Новосибирск; 2005. 7: 158–65. [Nazarenko S. A., Suhanova N. N., Lebedev I. N., Nikitina T. V., Sazhenova I. A. Struktura hromosomnyh narushenij u 552 spontannyh abortusov tomskoj populjacii. Molekuljarno­biologicheskie tehnologii v medicinskoj praktike. Novosibirsk; 2005. 7: 158–65. (in Russian)]
  7. Govaerts I., Koenig I., Van den Bergh M., Bertrand E., Revelard Ph., Englert Y. Is intracytoplasmic sperm injection (ICSI) a safe procedure? What do we learn from early pregnancy data about ICSI? Hum. Reprod. 1996; 11(2): 440–3.
  8. Martin R. H. The risk of chromosomal abnormalities following ICSI. Hum. Reprod. 1996; 10(7): 924–5.
  9. Золотухина Т. В., Витязева И. И., Здановский В. М., Шилова Н. В., Мельникова Л. Л. Комплексное обследование в семьях с неразвивающимися беременностями, наступившими в результате вспомогательных репродуктивных технологий. Методические рекомендации. 2003; 51: 17. [Zolotukhina T. V., Vityazeva I. I., Zdanovskii V. M., Shilova N. V., Mel'nikova L. L. Kompleksnoe obsledovanie v sem'yakh s nerazvivayushchimisya beremennostyami, nastupivshimi v rezul'tate vspomogatel'nykh reproduktivnykh tekhnologii. Metodicheskie rekomendatsii. 2003; 51: 17. (in Russian)]

Новости

1 Ноября 12:32
V Московский Городской Съезд педиатров состоится 19–21 ноября 2019 года

Приглашаем посетить главное ежегодное мероприятие в сфере здравоохранения детей и подростков — «V Московский городской Съезд педиатров» 19 – 21 ноября 2019 года (г. Москва, МВЦ «Крокус Экспо»)

31 Октября 16:36
20–22 ноября 2019 года в Москве состоится XIV Национальный конгресс терапевтов

Приглашаем посетить главное ежегодное мероприятие Российского научного медицинского общества терапевтов

24 Октября 13:09
В преддверии Дня борьбы с инсультом: вопросы лечения и реабилитации

23 октября 2019 г. в Москве прошла совместная пресс-конференция компании «Такеда» и ведущих специалистов Национального медико-хирургического центра им. Н.И. Пирогова. Специалисты обсудили статистику заболеваемости в России и Москве, задачи, стоящие перед экспертами здравоохранения, существующие возможности в лечении острого инсульта и реабилитацию пациентов после инсульта

7 Октября 20:23
12 декабря в Морозовской больнице пройдут Лунц-Мазуринские чтения

Уважаемые коллеги, приглашаем вас 12 декабря 2019 года принять участие в «Лунц-Мазуринских чтениях», которые пройдут в ГБУЗ «Морозовская ДГКБ ДЗМ».

Все новости

Партнеры