Причины генитального эндометриоза до сих пор остаются загадкой, разгадать которую пытаются ведущие ученые всего мира. Одной из наиболее часто встречающихся форм генитального эндометриоза является наружный генитальный эндометриоз (НГЭ), разнообразные варианты которого чаще всего проявляются тазовой болью (ТБ).
Несмотря на многочисленные исследования и полуторавековое изучение эндометриоза, причины развития заболевания и связанной с ним патологической болевой импульсации до сих пор непонятны, и ни одна из предложенных теорий не объясняет происхождение эндометриоза [1, 2].
Вместе с тем в зарубежной и отечественной литературе появляется все больше данных о влиянии концентрации витамина D на тяжесть ТБ, ассоциированной с НГЭ [3, 4].
Выявлено, что экспрессия VDR в клетках эндометрия подвержена циклическим изменениям как в норме, так и при эндометриозе. В клеточном метаболизме 25(ОН)D также происходят пролиферативно-зависимые сдвиги — изменение экспрессии ключевых ферментов метаболического пути витамина D: 1-α-гидроксилазы (1α-OH), обеспечивающей синтез активной формы витамина D (1,25(OH)2D3), и 24-гидроксилазы (24-ОН), обусловливающей ее инактивацию [5].
Изучение роли концентрации витамина D в патогенезе НГЭ и ассоциированной с ним ТБ представляет несомненный практический интерес, что и определило выбор цели настоящего исследования.
Цель исследования: расширить представления о патогенезе ТБ при НГЭ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Данное когортное проспективное сравнительное исследование проведено в период с 01.09.2016 г. по 01.07.2017 г. на базе кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии (НУЗ «Центральная клиническая больница № 6» ОАО «РЖД») медицинского факультета Медицинского института РУДН в рамках основной научно-исследовательской деятельности — «Репродуктивное здоровье населения Московского мегаполиса и пути его улучшения в современных экологических и социально-экономических условиях» (номер государственной регистрации — 01.9.70 007346, шифр темы — 317712).
В исследовании приняли участие 150 женщин, давших добровольное информированное согласие на включение их в изучаемую группу, забор биологического материала, изучение клинических и лабораторных показателей, статистическую обработку и публикацию полученных результатов.
Пациенток с НГЭ (n = 120) разделили на 2 группы с 2 подгруппами (А и B) в каждой. Участницы групп I и II были в возрасте от 20 лет до 41 года. I группу (n = 60) составили пациентки с НГЭ, осложненным ТБ: IA (n = 30) — c дефицитом 25(ОН)D, IB (n = 30) — без него; II группа (n = 60) — пациентки с НГЭ без ТБ: IIA (n = 30) — c дефицитом 25(ОН)D, IIB (n = 30) — без него. В группу контроля вошли 30 относительно здоровых женщин в возрасте от 22 до 39 лет, направленных на диагностическую лапароскопию по поводу бесплодия неясного генеза (МКБ-10: N97.9. Женское бесплодие неуточненное), без дефицита 25(ОН)D и диагностированного НГЭ, без ТБ.
Средний возраст женщин в основной группе составил 29,3 ± 3,5 года, в группе контроля — 28,8 ± 4,9 года (p = 0,241).
Критерии включения в I и II группы: лапароскопически и морфологически подтвержденный наружный генитальный эндометриоз (N80.1. Эндометриоз яичников), синдром ТБ (N94.8. Другие уточненные состояния, связанные с женскими половыми органами и менструальным циклом), репродуктивный возраст.
Критерии исключения: наличие сопутствующих гинекологических заболеваний воспалительной и невоспалительной этиологии, сопровождающихся синдромом ТБ: варикозной болезни, системных заболеваний, спаечной болезни, интерстициального цистита, миофасциального болевого синдрома, синдрома раздраженного кишечника, ТБ, обусловленной неврологическими расстройствами, психогенной боли.
У всех участниц исходно определяли уровень общего 25(ОН)D в сыворотке крови методом масс-cпектрометрии, адаптированным к клинической практике согласно международным стандартам (Vitamin D External Quality Assessment Scheme, National Institute of Standards and Technology), по аттестованной в соответствии с ГОСТ Р 8.563-2009 методике [6]. Исследование выполняли в лаборатории ООО «Клиника новых медицинский технологий «АрхиМед» (заведующий лабораторией — к. б. н. Нижник А.Н.).
Дефицит витамина D диагностировали при концентрации 25-гидроксивитамина-D3 < 20 нг/мл (< 50 нмоль/л), недостаточность — от 20 до 30 нг/мл (от 50 до 75 нмоль/л), а нормальный уровень — 31–100 нг/мл (76–250 нмоль/л).
Биоптаты эндометрия, полученные в ходе пайпель-биопсии, а также стенки капсул эндометриоидных кист яичника фиксировали в забуференном HCl 10%-м формалине (рН = 7,2; от 5 до 24 часов); дегидратировали в батарее спиртов восходящей концентрации (аппарат гистологической проводки тканей фирмы Leica Biosystems, Германия) и заливали в парафин. Срезы тканей толщиной ≈4 мкм помещали на обычные, а для иммуногистохимического (ИГХ) исследования — на специальные адгезивные предметные стекла SuperFrost Plus (Menzel-Glаser, Polylisine, Германия), депарафинизировали, согласно принятой стандартной методике. Впоследствии срезы либо окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования, либо использовали для ИГХ.
ИГХ-исследование проводили после депарафинизации и регидратации парафиновых срезов по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-maX (Leica Biosystems). В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела (Abcam, Великобритания) к VEGF-A (Anti-VEGFA antibody, Clone ab46154, 1:400) и кроличьи к VDR (Anti-Vitamin D Receptor, Clone ab3508, 1:300) и CASP3 (Anti-Caspase3 antibody, Clone E87, 1:50), NGF (Anti-NGF antibody, Clone ab52918, 1:300). Исследования выполняли в гистохимической лаборатории 9-го Лечебно-диагностического центра Министерства обороны РФ.
Полученные в результате подсчета данные статистически обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 7.5 for Windows Statistical Software Package (IBM Analytics, США). При этом определяли вариационные ряды, выборочное среднее, стандартную ошибку выборочного среднего (SEM) и вероятность различия. Затем оценивали соответствие/несоответствие полученных результатов нормальному распределению с применением критерия Колмагорова — Смирнова.
При статистической обработке для оценки достоверности различий средних значений между группами использовались непараметрические U-критерий Манна — Уитни, Н-критерий Краскелла — Уоллеса. При отсутствии нормального распределения данных применяли непараметрический критерий Вилкоксона (Statistical Methods for Research Workers) с уровнем значимости p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При микроскопическом исследовании полученных биоптатов эндометрия во всех образцах обнаружили фазы пролиферации менструального цикла — маточные железы с ровным контуром на фоне преобладания эпителиального компартмента над стромальным.
По данным морфометрического анализа железистого компартмента эндометрия, статистически значимых различий в высоте клеток железистого эпителия, диаметре желез и их плотности на единицу площади в I и II группах по сравнению с группой контроля не было (р > 0,05).
В биоптатах капсулы эндометриоидных кист пациенток с НГЭ на фоне стромы яичника определялись отдельные участки эктопического эндометрия, выстланные однослойным кубическим эпителием с единичными реснитчатыми клетками, частицы сплющенных эндометриоидных желез, а также отложения гематина и гемосидерина с признаками локального экстравазального гемосидероза. Описанная выше патоморфологическая картина свидетельствует о функциональной активности процесса в виде пролиферативных изменений эпителия желез и эндометриоидных кист, ангиоматоза цитогенной стромы, скопления секрета в железах и кистах, высокой частоты «старых» кровоизлияний в железах, кистах и строме.
Морфометрический анализ плотности ИГХ-маркирования VDR указывает на статистически значимые различия между подгруппами с и без дефицита 25(ОН)D у женщин с НГЭ-ассоциированной ТБ, а также между этими подгруппами и контролем. В подгруппе с дефицитом 25(ОН)D данный показатель составил 71,1 ± 3,7%, что в среднем превышает аналогичный показатель в подгруппе без него (44,2 ± 2,8%) в 1,6 раза (р < 0,05). По сравнению с группой контроля (31,5 ± 2,1%) иммунологическое маркирование VDR в подгруппе с дефицитом 25(ОН)D было выше в 2,3 раза (р < 0,05).
В то же время в ходе ИГХ-исследования капсул эндометриоидных кист в железистом эпителии стенок эндометриоидных кист яичников обнаружили увеличение доли ИГХ-позитивных на VDR клеток в 2,7 раза в подгруппе А (86,3 ± 2,2%) и в 2,0 раза в подгруппе В (63,6 ± 3,4%) по сравнению с контролем (р < 0,05). Различие между подгруппами А и В также было статистически значимым (р < 0,05).
В строме эндометриоидных кист яичников выявили увеличение доли ИГХ-позитивных элементов на VEGF в 2,7 раза в подгруппе А (77,4 ± 3,5%) и в 2,0 раза в подгруппе В (56,3 ± 2,8%, р < 0,05) при значении в группе контроля 28,2 ± 1,1 (р < 0,05 для отличия от подгрупп женщин с НГЭ и ТБ).
Фактор роста нервов (NGF) демонстрировал выраженную (3 балла) положительную стромальную реакцию в образцах биоптатов эндометрия и стенок эндометриоидных кист яичника I группы (НГЭ с ТБ), в группе контроля — слабую (1 балл) и местами умеренную (2 балла), но незначительную ИГХ-реакцию. В эутопическом эндометрии женщин подгруппы IА (с дефицитом 25(ОН)D) наблюдали выраженное иммуномечение NGF (3 балла) во многих фокусах диффузного характера, преимущественно периваскулярно и перигландулярно (47,3 ± 3,2%), что соответствует наиболее значимым участкам тканевой иннервации эндометрия. В подгруппе без дефицита 25(ОН)D данный показатель составил 36,1 ± 2,8% (р < 0,05 для отличия от подгруппы IА), а в контроле — 15,7 ± 1,5% (р < 0,05 для отличия от подгрупп IА и IВ).
В строме эндометриоидных кист яичника отмечали увеличение доли ИГХ-позитивных клеток, экспрессирующих NGF, носивших периневральный и пери- и интраганглионарный характер, сопровождающих инфильтративный рост эндометриодной ткани: рост площади экспрессии в 4,1 раза в подгруппе А (63,7 ± 2,1%) и в 2,9 раза в подгруппе В (45,8 ± 1,9%, р < 0,05) по сравнению с группой контроля (15,7 ± 1,5%, р < 0,05).
Данная картина предположительно обусловлена нарушениями в молекулярно-клеточных процессах в эндометрии, которые развиваются на фоне НГЭ и метаболического дисбаланса 25(ОН)D и усиления неоангиогенеза.
В ходе морфометрии в биоптатах эутопического эндометрия были установлены статистически значимые различия в относительной ИГХ-экспрессии CASP3 между подгруппами I группы и группой контроля. В подгруппе с дефицитом 25(ОН)D на фоне НГЭ-ассоциированной ТБ показатель относительной плотности маркирования составил 26,1 ± 1,5%, что в 1,1 раза выше аналогичного параметра у женщин без дефицита 25(ОН)D (28,4 ± 1,2%, р < 0,05) и в 1,2 раза ниже значений группы контроля (31,6 ± 1,7%, р < 0,05).
В эпителии и местами в строме эндометриоидных кист яичника отмечали увеличение количества ИГХ-позитивных на CASP3 клеток в 1,5 раза в подгруппе IА (22,1 ± 1,7%) и в 1,2 раза в подгруппе IВ (28,4 ± 1,2%) по сравнению с группой контроля (32,3 ± 1,7%, р < 0,05). Различие между подгруппами также было статистически значимым (р < 0,05).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выявленные изменения показывают смещение пролиферативно-апоптотического индекса в сторону снижения активности апоптоза в клетках эутопического и эктопического эндометрия при диагностированном дефиците 25(ОН)D.
Результаты исследования свидетельствуют о дефектном метаболизме 25(ОН)D, изменения субстрат-ферментного соотношения косвенно подтверждают его дефицит. Аналогичная зависимость наблюдается в экспрессии VDR, что подтверждает результаты проведенного ИГХ-исследования на маркирование VDR в эндометрии и капсулах эндометриоидных кист у пациенток с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ). Она лежит в основе ведущего патогенетического механизма возникновения тазовой боли при НГЭ в условиях снижения антипролиферативного действия витамина D на ткани при его дефиците в сыворотке крови. Это сопровождается усилением локального неоангиогенеза и роста нервных волокон с изменением пролиферативно-апоптотического паттерна в сторону угнетения апоптоза и усиления пролиферации.
